تتبع انحلال الفيبرين لجلطات الدم الكاملة المكونة من حلقة تشاندلر تحت تدفق القص في نموذج انحلال الخثرة في المختبر
Summary
غالبا ما كافحت فحوصات انحلال الخثرة في المختبر لتكرار الظروف داخل الجسم الحي سواء في نموذج الجلطة الذي يتم هضمه أو في البيئة التي يحدث فيها انحلال الخثرة. هنا ، نستكشف كيفية استخدام اقتران حلقة تشاندلر ومقايسة انحلال الفيبرين المتدفق الفلورومتري في الوقت الفعلي (RT-FluFF) لمراقبة تحلل الجلطة عالية الدقة ، خارج الجسم الحي.
Abstract
الجلطات الدموية والمضاعفات ذات الصلة هي السبب الرئيسي للمراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم ، وقد تم تطوير فحوصات مختلفة لاختبار كفاءة الأدوية الانحلالية للتخثر في كل من المختبر والجسم الحي. هناك طلب متزايد على نماذج الجلطات في المختبر ذات الصلة الفسيولوجية لتطوير الأدوية بسبب التعقيد والتكلفة المرتبطة بالنماذج الحيوانية بالإضافة إلى افتقارها في كثير من الأحيان إلى قابلية الترجمة إلى فسيولوجيا الإنسان. يعد التدفق والضغط ومعدل القص من الخصائص المهمة للجهاز الدوري ، حيث تظهر الجلطات التي تتشكل تحت التدفق خصائص مورفولوجية وهضمية مختلفة عن الجلطات المتكونة بشكل ثابت. غالبا ما تكون هذه العوامل غير ممثلة في فحوصات هضم الجلطات التقليدية في المختبر ، والتي يمكن أن يكون لها آثار دوائية تؤثر على معدلات نجاح ترجمة الأدوية.
تم تطوير اختبار انحلالالخثرة Real-T ime Flu Flumetric Flowing F(RT-FluFF) كمنصة اختبار انحلال الخثرة عالية الدقة تستخدم جلطات موسومة بالفلورسنت تتشكل تحت تدفق القص ، والتي يتم هضمها بعد ذلك باستخدام البلازما المنتشرة في وجود أو عدم وجود عوامل صيدلانية محللة للفبرين. يسمح تعديل معدلات التدفق لكل من خطوات تكوين الجلطة وهضم الجلطة للنظام بتقليد الحالات الشريانية والرئوية والوريدية عبر إعدادات تجريبية متنوعة للغاية. يمكن إجراء القياسات بشكل مستمر باستخدام مقياس الفلور المضمن أو عن طريق أخذ نقاط زمنية منفصلة ، بالإضافة إلى قياس كتلة جلطة نقطة النهاية التقليدية. اختبار RT-FluFF هو نظام مرن يسمح بالتتبع في الوقت الفعلي لهضم الجلطة في ظل ظروف التدفق التي تمثل بدقة أكبر الظروف الفسيولوجية في الجسم الحي مع الاحتفاظ بالتحكم في نظام الاختبار في المختبر وإمكانية استنساخه.
Introduction
تمثل الأمراض الناجمة أساسا عن مسببات الانصمام الخثاري مصدرا رئيسيا للمراضة والوفيات في المجتمع الحالي. تشمل مظاهر التسبب في الانسداد الخثاري ، على سبيل المثال لا الحصر ، احتشاء عضلة القلب والسكتات الدماغية الإقفارية والجلطات الوريدية العميقة والصمات الرئوية1. يدور قدر هائل من الأبحاث الجارية ، التي تغطي تخصصات متعددة ، حول تطوير طرق آمنة وفعالة للتعامل مع تجلط الدم الممرض. أدت الاختلافات في المظاهر الشريانية والوريدية للتخثر والمواقع التشريحية المختلفة إلى تطوير مناهج علاجية مختلفة. ومع ذلك ، يعتمد العلاج الحاد عموما على استخدام انحلال الخثرة الدوائي عبر منشطات البلازمينوجين مع إمكانية استئصال الخثرة الميكانيكية في ظل ظروف سريرية معينة2.
يعتمد تطوير استراتيجيات العلاج الدوائي الجديدة بشكل أساسي على كل من النماذج الحيوانية في الجسم الحي ونماذج الهضم في المختبر للاختبارات قبل السريرية 3,4. تستفيد النماذج في الجسم الحي بشكل طبيعي من قدرتها على التقاط التفاعل المعقد لمختلف المعلمات الفسيولوجية على فعالية العلاج التي تشمل إزالة العوامل الصيدلانية وكذلك التفاعلات الخلوية مع الأدوية. ومع ذلك ، فإن هذا التعقيد نفسه غالبا ما يجعل مثل هذه النماذج مكلفة للغاية ويقدم مشكلات إضافية عند محاولة عزل الديناميات الدوائية / الحركية الأساسية في التي تختلف اختلافا كبيرا عن علم وظائف الأعضاء البشرية. ساعد تطوير النماذج في المختبر من خلال تسهيل إعداد الاختبار المقطر الذي يمكن فيه إجراء تطوير الأدوية وفحصها ولكنه غالبا ما يفتقر إلى الدقة اللازمة لتلخيص حالة المرض قيد الدراسة.
تعتمد البروتوكولات المختبرية الشائعة لاختبار التخثر الجديد على استخدام الجلطات التي تشكلت وتحلل في ظل ظروف ثابتة حيث تعمل كتلة الجلطة المتبقية كنقطة نهاية أولية 5,6. لسوء الحظ ، تفشل هذه التقنيات في حساب الجوانب الميكانيكية لتحلل الجلطة مثل التدفق المضطرب وانخفاض ضغط الخثرة التي يمكن أن تغير بشكل كبير الديناميكا الدوائية لأدوية الاختبار. بالإضافة إلى ذلك ، تحتوي الجلطات المتكونة في ظل ظروف ثابتة على بنية دقيقة تختلف عن الجلطات الفسيولوجية. وقد تبين أن وجود القص أثناء تكوين الجلطة يؤثر بشكل متكرر على خصائص الجلطة الناتجة مثل تنشيط الصفائح الدموية وتشابك الفيبرين. تظهر الجلطات التي يتم إنتاجها تحت تدفق القص عدم تجانس معقد من الطرف إلى الذيل الغائب في الجلطات المكونةبشكل ثابت 7,8. قد تؤثر مثل هذه الانحرافات عن بنية الجلطة الفسيولوجية على توصيف تطوير الدواء المهم الذي يتضمن تغلغل الدواء داخل الجلطة وكفاءة التحلل اللاحقة9.
لمعالجة بعض هذه القيود المرتبطة باستخدام نماذج التخثر / تحلل الجلطة الثابتة ، شهد اعتماد حلقة تشاندلر لكل من تكوين الجلطة وتحلل الجلطة في وجود القص عودة10. على الرغم من أن هذه الأنظمة تسمح بتمثيل أفضل لديناميكيات التدفق وتوليد جلطات ذات بنية أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية مقارنة بالمقايسات الثابتة نسبيا ، إلا أن ظروف التدفق المبسطة لا تزال تمثل انحرافا عن الظروف الفسيولوجية. وأخيرا، اتخذت أيضا نهج الموائع الدقيقة نظرا لسهولة تصويرها وأنماط تدفقها الموحدة؛ ومع ذلك ، فإنها تظل إزالة كبيرة من الظروف الفسيولوجية المتوقعة داخل الأوعية الكبيرة المتأثرة بشكل أساسي في معظم اضطرابات الانسداد الخثاري ذات الصلةسريريا 11,12.
مع وضع المناقشة أعلاه في الاعتبار ، قمنا بتطوير نموذج انحلال الخثرة عالي الدقة في المختبر لفحص الأدوية قبل السريرية. يهدف النموذج إلى معالجة بعض المزالق الحالية المفصلة أعلاه في مجال فحص العلاج بالتخثر الجديد وتم التحقق من صحته من أجل التكاثر والحساسية بتركيزات متفاوتة من منشط البلازمينوجين النسيجي (tPA). يوفر النظام الموصوف هنا تدفقات قص فسيولوجية باستخدام مضخة تمعجية ، ومثبط ضغط ، وخزان ساخن ، ومستشعرين للضغط ، ومقياس فلوري في الخط ، وتناظرية جلطة على شكل قص حلقة تشاندلر تسمى الفلورسنت لتسهيل التتبع في الوقت الفعلي لانحلال الفيبرين13. مجتمعة ، يطلق على النظام العام اسم مقايسة انحلال الفيبرين المتدفق الفلورومتري في الوقت الفعلي (RT-FluFF Assay)14 وستناقش هذه المخطوطة تعقيدات إعداد وتشغيل المقايسات بنجاح في نموذج انحلال الخثرة في المختبر عالي الدقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تشكيل الجلطة ووضع العلامات
لقد ثبت أن حلقة تشاندلر توفر وسيلة سهلة وفعالة لتوليد جلطات تحاكي الجلطات الدموية16 في الجسم الحي. تسمح معلمات الضبط الدقيق مثل حجم الأنبوب وسرعات الدوران وقطر الأسطوانة ووقت التخثر بالتوليد السريع للجلطات في ظل ظروف قص مختلفة يمكنه…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم البحث الوارد في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للقلب والرئة والدم التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم R01HL167877. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| 30 G Disposable Hypodermic Needles | Exel International | 26439 | Other Consumables |
| 6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long | uxcell | B07SXGSQ82 | Chandler loop, |
| 96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate | Corning | 3635 | Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile |
| Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes | Air-Tite | MLB3 | RT-FluFF Apparatus , dampeners |
| Arium Mini Plus Ultrapure Water System | Sartorius | NA | DI water source |
| Calcium Chloride | Millipore Sigma | C5670 | Other Consumables |
| Disposable BP Transducers | AD Instruments | MLT0670 | RT-FluFF Apparatus |
| Drager Siemans HemoMed Pod | Drager | 5588822 | RT-FluFF Apparatus |
| Drager Siemans Patient Monitor | Drager | SC 7000 | RT-FluFF Apparatus |
| Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm) | Chandler loop, | ||
| Face Shield | Moxe | SHIELDS10 | Chandler loop, |
| Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Scientific | F13191 | Other Consumables |
| Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile | Masterflex | 30600-04 | RT-FluFF Apparatus |
| Fluorescein (FITC) | Thermo Scientific | 119245000 | Other Consumables |
| General-Purpose Water Bath | Thermo Scientific | 2839 | Chandler loop, |
| Hotplate 4 × 4 | Fisher Scientific | 1152016H | RT-FluFF Apparatus |
| Human Source Plasma Fresh-Frozen | Zen-Bio | SER-SPL | Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant |
| Human Whole Blood | Zen-Bio | SER-WB-SDS | Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant |
| L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor | Masterflex | 77200-62 | RT-FluFF Apparatus, Pump Head |
| L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC | Masterflex | 7528-10 | RT-FluFF Apparatus, Pump |
| Motor Speed Controller | CoCocina | ZK-MG | Chandler loop, |
| Nalgene Tubing T-Type Connectors | Thermo Scientific | 6151-0312 | RT-FluFF Apparatus |
| Peristaltic pump tubing | Masterflex | 06424-15 | Other Consumables |
| Phosphate buffered saline | Millipore Sigma | P3813 | Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system (or other fluorescence detection) | Molecular Devices | M5 | RT-FluFF Apparatus |
| Switching Power Supply | SoulBay | UC03U | Chandler loop, |
| Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL | Thermo Scientific | S751010 | Other Consumables |
| Tissue plasminogen activator, human | Millipore Sigma | T0831 | Other Consumables |
| Tubing ID 1/4'', OD 3/8'' | Fisher Scientific | AGL00017 | Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors |
| Tubing ID 5/32", OD 7/32" | Tygon | ND-100-65, ADF 00009 | Other Consumables |
| V3 365 nm Mini – Black Light UV Flashlight | uvBeast | uvB-V3-365-MINI | Chandler loop, used to check completed clots |
| ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm | Pangyoo | ZGA37RG | Chandler loop, |
References
- Ali, M. R., et al. Aspect of thrombolytic therapy: a review. Scientific World Journal. 2014, 586510 (2014).
- Bhogal, P., Andersson, T., Maus, V., Mpotsaris, A., Yeo, L. Mechanical thrombectomy-A brief review of a revolutionary new treatment for thromboembolic stroke. Clin Neuroradiol. 28 (3), 313-326 (2018).
- Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
- Kaiser, E. E., West, F. D. Large animal ischemic stroke models: replicating human stroke pathophysiology. Neural Regen Res. 15 (8), 1377-1387 (2020).
- Elnager, A., et al. In vitro whole blood clot lysis for fibrinolytic activity study using d-dimer and confocal microscopy. Adv Hematol. 2014, 814684 (2014).
- Prasad, S., et al. Development of an in vitro model to study clot lysis activity of thrombolytic drugs. Thromb J. 4, 14 (2006).
- Robbie, L. A., Young, S. P., Bennett, B., Booth, N. A. Thrombi formed in a Chandler loop mimic human arterial thrombi in structure and RAI-1 content and distribution. Thromb Haemost. 77 (3), 510-515 (1997).
- Mutch, N. J., et al. Model thrombi formed under flow reveal the role of factor XIII-mediated cross-linking in resistance to fibrinolysis. J Thromb Haemost. 8 (9), 2017-2024 (2010).
- Blinc, A., Kennedy, S. D., Bryant, R. G., Marder, V. J., Francis, C. W. Flow through clots determines the rate and pattern of fibrinolysis. Thromb Haemost. 71 (2), 230-235 (1994).
- Mutch, N. J., et al. The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro. Br J Pharmacol. 153 (1), 124-131 (2008).
- Herbig, B. A., Yu, X., Diamond, S. L. Using microfluidic devices to study thrombosis in pathological blood flows. Biomicrofluidics. 12 (4), 042201 (2018).
- Jigar Panchal, H., Kent, N. J., Knox, A. J. S., Harris, L. F. Microfluidics in haemostasis: A review. Molecules. 25 (4), 833 (2020).
- Zeng, Z., et al. Fluorescently conjugated annular fibrin clot for multiplexed real-time digestion analysis. J Mater Chem B. 9 (45), 9295-9307 (2021).
- Zeng, Z., Christodoulides, A., Alves, N. J. Real-time tracking of fibrinolysis under constant wall shear and various pulsatile flows in an in-vitro thrombolysis model. Bioeng Transl Med. 8 (3), e10511 (2023).
- Christodoulides, A., Zeng, Z., Alves, N. J. In-vitro thromboelastographic characterization of reconstituted whole blood utilizing cryopreserved platelets. Blood Coagul Fibrinolysis. 32 (8), 556-563 (2021).
- Zeng, Z., Nallan Chakravarthula, T., Christodoulides, A., Hall, A., Alves, N. J. Effect of Chandler loop shear and tubing size on thrombus architecture. J Mater Sci Mater Med. 34 (5), 24 (2023).
- Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop. J Biomech Eng. 136 (7), (2014).
- Wojdyla, M., Raj, S., Petrov, D. Absorption spectroscopy of single red blood cells in the presence of mechanical deformations induced by optical traps. J Biomed Opt. 17 (9), (2012).
- Wu, J. H., Diamond, S. L. A fluorescence quench and dequench assay of fibrinogen polymerization, fibrinogenolysis, or fibrinolysis. Anal Biochem. 224 (1), 83-91 (1995).
