Verfolgung der Fibrinolyse von Chandler-Schleifen-gebildeten Vollblutgerinnseln unter Scherströmung in einem In-vitro-Thrombolysemodell
Summary
In-vitro-Thrombolyse-Assays haben oft Schwierigkeiten, In-vivo-Bedingungen zu replizieren, sei es im Modellthrombus, der verdaut wird, oder in der Umgebung, in der die Thrombolyse stattfindet. Im Folgenden untersuchen wir, wie die Kopplung des Chandler-Loops und des Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF) für eine hochgenaue Ex-vivo-Überwachung der Gerinnsellyse verwendet wird.
Abstract
Thromboembolien und damit verbundene Komplikationen sind weltweit eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität, und es wurden verschiedene Assays entwickelt, um die Wirksamkeit thrombolytischer Arzneimittel sowohl in vitro als auch in vivo zu testen. Die Nachfrage nach physiologisch relevanteren In-vitro-Gerinnselmodellen für die Arzneimittelentwicklung steigt aufgrund der Komplexität und der Kosten, die mit Tiermodellen verbunden sind, sowie ihrer oft fehlenden Übertragbarkeit auf die Humanphysiologie. Strömung, Druck und Schergeschwindigkeit sind wichtige Eigenschaften des Kreislaufsystems, wobei Gerinnsel, die unter Fluss gebildet werden, eine andere Morphologie und Verdauungseigenschaften aufweisen als statisch gebildete Gerinnsel. Diese Faktoren sind in herkömmlichen In-vitro-Assays für den Gerinnselverdau oft nicht vertreten, was pharmakologische Implikationen haben kann, die sich auf die translationalen Erfolgsraten von Arzneimitteln auswirken.
Der Real-T ime Fluorometric Flowing Fibrinolysis (RT-FluFF) Assay wurde als High-Fidelity-Thrombolyse-Testplattform entwickelt, bei der fluoreszenzmarkierte Gerinnsel verwendet werden, die unter Scherfluss gebildet und dann mit zirkulierendem Plasma in Gegenwart oder Abwesenheit von fibrinolytischen pharmazeutischen Wirkstoffen verdaut werden. Die Modifikation der Flussraten sowohl der Gerinnselbildung als auch der Gerinnselverdauungsschritte ermöglicht es dem System, arterielle, pulmonale und venöse Erkrankungen in sehr unterschiedlichen Versuchsanordnungen zu imitieren. Die Messungen können kontinuierlich mit einem Inline-Fluorometer oder durch Messung diskreter Zeitpunkte sowie mit einer herkömmlichen Endpunkt-Gerinnselmassenmessung durchgeführt werden. Der RT-FluFF-Assay ist ein flexibles System, das die Echtzeit-Verfolgung des Gerinnselverdaus unter Flussbedingungen ermöglicht, die die physiologischen Bedingungen in vivo genauer darstellen und gleichzeitig die Kontrolle und Reproduzierbarkeit eines In-vitro-Testsystems beibehalten.
Introduction
Krankheiten, die im Wesentlichen auf thromboembolische Ätiologien zurückzuführen sind, stellen in der heutigen Gesellschaft eine Hauptursache für Morbidität und Mortalität dar. Zu den Manifestationen der thromboembolischen Pathogenese gehören unter anderem Myokardinfarkte, ischämische Schlaganfälle, tiefe Venenthrombosen und Lungenembolien1. Ein enormer Teil der laufenden Forschung, die sich über mehrere Disziplinen erstreckt, dreht sich um die Entwicklung sicherer und wirksamer Methoden für den Umgang mit pathogenen Thrombosen. Unterschiedliche arterielle und venöse Manifestationen der Thrombose und unterschiedliche anatomische Lokalisationen haben zur Entwicklung unterschiedlicher Behandlungsansätze geführt. Die Akutbehandlung beruht jedoch im Allgemeinen auf dem Einsatz einer pharmakologischen Thrombolyse über Plasminogenaktivatoren, die unter bestimmten klinischen Umständen eine mechanische Thrombektomie ermöglichenkönnen 2.
Die Entwicklung neuartiger pharmakologischer Behandlungsstrategien stützt sich grundsätzlich sowohl auf In-vivo-Tiermodelle als auch auf In-vitro-Verdauungsmodelle für die präklinische Erprobung 3,4. In-vivo-Modelle profitieren natürlich von ihrer Fähigkeit, das komplexe Zusammenspiel verschiedener physiologischer Parameter auf die Wirksamkeit der Behandlung zu erfassen, einschließlich der Clearance von pharmazeutischen Wirkstoffen sowie zellulärer Wechselwirkungen mit Arzneimitteln. Dieselbe Komplexität macht solche Modelle jedoch oft recht kostspielig und führt zu zusätzlichen Problemen beim Versuch, die zugrunde liegende Pharmakodynamik/Kinetik bei Tieren zu isolieren, die sich erheblich von der menschlichen Physiologie unterscheidet. Die Entwicklung von In-vitro-Modellen hat dazu beigetragen, dass eine destillierte Testumgebung ermöglicht wurde, in der die Entwicklung und das Screening von Arzneimitteln durchgeführt werden können, die jedoch oft nicht die erforderliche Genauigkeit aufweisen, um den untersuchten Krankheitszustand zu rekapitulieren.
Häufig anzutreffende In-vitro-Protokolle zur Erprobung neuartiger Thrombolytika beruhen auf der Verwendung von Gerinnseln, die unter statischen Bedingungen gebildet und lysiert werden, wobei die verbleibende Gerinnselmasse als primärer Endpunkt dient 5,6. Leider berücksichtigen solche Techniken nicht die mechanischen Aspekte der Gerinnsellyse, wie z. B. turbulente Strömung und transthrombusische Druckabfälle, die die Pharmakodynamik von Testmedikamenten erheblich verändern können. Darüber hinaus enthalten Gerinnsel, die unter statischen Bedingungen gebildet werden, eine Mikroarchitektur, die sich von physiologischen Gerinnseln unterscheidet. Es wurde reproduzierbar gezeigt, dass das Vorhandensein von Scherung während der Gerinnselbildung die resultierenden Gerinnseleigenschaften wie Thrombozytenaktivierung und Fibrinvernetzung beeinflusst. Gerinnsel, die unter Scherströmung erzeugt werden, weisen eine komplexe Heterogenität von der Spitze bis zum Ende auf, die bei statisch gebildeten Gerinnseln nicht vorhanden ist 7,8. Solche Abweichungen von der physiologischen Gerinnselarchitektur können sich auf die Charakterisierung wichtiger Arzneimittelentwicklungen auswirken, die die Wirkstoffpenetration innerhalb eines Thrombus und die anschließende Lyseeffizienz umfassen9.
Um einige dieser Einschränkungen im Zusammenhang mit der Verwendung von statischen Gerinnungs-/Gerinnungslysemodellen zu beheben, hat die Einführung der Chandler-Schleife sowohl für die Gerinnselbildung als auch für die Gerinnsellyse in Gegenwart von Scherung ein Wiederaufleben erlebt10. Obwohl solche Systeme eine bessere Darstellung der Strömungsdynamik ermöglichen und Gerinnsel mit einer physiologisch relevanteren Architektur im Vergleich zu relativ statischen Assays erzeugen, stellen ihre vereinfachten Strömungsbedingungen immer noch eine Abweichung von den physiologischen Bedingungen dar. Schließlich wurden auch mikrofluidische Ansätze aufgrund ihrer einfachen Bildgebung und ihrer gleichmäßigen Strömungsmuster verfolgt. Sie bleiben jedoch eine signifikante Entfernung von den physiologischen Bedingungen, die bei den größeren Gefäßen erwartet werden, die hauptsächlich von den meisten klinisch relevanten thromboembolischen Erkrankungen betroffen sind11,12.
Vor dem Hintergrund der obigen Diskussion haben wir ein hochgenaues In-vitro-Thrombolysemodell für das präklinische Thrombolytik-Screening entwickelt. Das Modell zielt darauf ab, einige der oben beschriebenen aktuellen Fallstricke im Bereich des neuartigen thrombolytischen Therapie-Screenings zu beheben und wurde auf Reproduzierbarkeit und Sensitivität bei unterschiedlichen Konzentrationen von Gewebeplasminogenaktivator (tPA) validiert. Das hierin beschriebene System bietet physiologische Scherströmungen unter Verwendung einer Peristaltikpumpe, eines Druckdämpfers, eines beheizten Reservoirs, zweier Drucksensoren, eines Inline-Fluorometers und eines fluoreszenzmarkierten Chandler-Schleifen-schergebildeten Gerinnselanalogons, um die Echtzeitverfolgung der Fibrinolyse13 zu erleichtern. Zusammengenommen wird das Gesamtsystem als Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF Assay)14 bezeichnet, und in diesem Manuskript werden die Feinheiten der erfolgreichen Einrichtung und Durchführung von Assays in diesem hochpräzisen In-vitro-Thrombolysemodell erörtert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gerinnselbildung und -kennzeichnung
Es wurde gezeigt, dass die Chandler-Schleife ein einfaches und effektives Mittel zur reproduzierbaren Erzeugung von Gerinnseln darstellt, die In-vivo-Thromben nachahmen 16. Die Feinabstimmung von Parametern wie Schlauchgröße, Drehzahlen, Trommeldurchmesser und Gerinnungszeit ermöglicht die schnelle Bildung von Gerinnseln unter unterschiedlichen Scherbedingungen, die architektonische Merkmale erfassen können, die bei einer Reihe v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde vom National Heart, Lung, And Blood Institute der National Institutes of Health unter der Preisnummer R01HL167877 unterstützt. Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health wieder.
Materials
| 30 G Disposable Hypodermic Needles | Exel International | 26439 | Other Consumables |
| 6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long | uxcell | B07SXGSQ82 | Chandler loop, |
| 96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate | Corning | 3635 | Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile |
| Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes | Air-Tite | MLB3 | RT-FluFF Apparatus , dampeners |
| Arium Mini Plus Ultrapure Water System | Sartorius | NA | DI water source |
| Calcium Chloride | Millipore Sigma | C5670 | Other Consumables |
| Disposable BP Transducers | AD Instruments | MLT0670 | RT-FluFF Apparatus |
| Drager Siemans HemoMed Pod | Drager | 5588822 | RT-FluFF Apparatus |
| Drager Siemans Patient Monitor | Drager | SC 7000 | RT-FluFF Apparatus |
| Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm) | Chandler loop, | ||
| Face Shield | Moxe | SHIELDS10 | Chandler loop, |
| Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Scientific | F13191 | Other Consumables |
| Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile | Masterflex | 30600-04 | RT-FluFF Apparatus |
| Fluorescein (FITC) | Thermo Scientific | 119245000 | Other Consumables |
| General-Purpose Water Bath | Thermo Scientific | 2839 | Chandler loop, |
| Hotplate 4 × 4 | Fisher Scientific | 1152016H | RT-FluFF Apparatus |
| Human Source Plasma Fresh-Frozen | Zen-Bio | SER-SPL | Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant |
| Human Whole Blood | Zen-Bio | SER-WB-SDS | Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant |
| L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor | Masterflex | 77200-62 | RT-FluFF Apparatus, Pump Head |
| L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC | Masterflex | 7528-10 | RT-FluFF Apparatus, Pump |
| Motor Speed Controller | CoCocina | ZK-MG | Chandler loop, |
| Nalgene Tubing T-Type Connectors | Thermo Scientific | 6151-0312 | RT-FluFF Apparatus |
| Peristaltic pump tubing | Masterflex | 06424-15 | Other Consumables |
| Phosphate buffered saline | Millipore Sigma | P3813 | Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system (or other fluorescence detection) | Molecular Devices | M5 | RT-FluFF Apparatus |
| Switching Power Supply | SoulBay | UC03U | Chandler loop, |
| Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL | Thermo Scientific | S751010 | Other Consumables |
| Tissue plasminogen activator, human | Millipore Sigma | T0831 | Other Consumables |
| Tubing ID 1/4'', OD 3/8'' | Fisher Scientific | AGL00017 | Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors |
| Tubing ID 5/32", OD 7/32" | Tygon | ND-100-65, ADF 00009 | Other Consumables |
| V3 365 nm Mini – Black Light UV Flashlight | uvBeast | uvB-V3-365-MINI | Chandler loop, used to check completed clots |
| ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm | Pangyoo | ZGA37RG | Chandler loop, |
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