Seguimiento de la fibrinólisis de coágulos de sangre entera formados en bucle de Chandler bajo flujo de cizallamiento en un modelo de trombólisis in vitro
Summary
Los ensayos de trombólisis in vitro a menudo han tenido dificultades para replicar condiciones in vivo, ya sea en el trombo modelo que se está digiriendo o en el entorno en el que se produce la trombólisis. En este artículo, exploramos cómo se utiliza el acoplamiento del bucle de Chandler y el ensayo de fibrinólisis fluorométrica de flujo en tiempo real (RT-FluFF) para el monitoreo de lisis de coágulos ex vivo de alta fidelidad.
Abstract
La tromboembolia y las complicaciones relacionadas son una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo, y se han desarrollado varios ensayos para probar la eficacia de los fármacos trombolíticos tanto in vitro como in vivo. Existe una creciente demanda de modelos de coágulos in vitro más relevantes fisiológicamente para el desarrollo de fármacos debido a la complejidad y el coste asociados a los modelos animales, además de su a menudo falta de traducibilidad a la fisiología humana. El flujo, la presión y la velocidad de cizallamiento son características importantes del sistema circulatorio, ya que los coágulos que se forman bajo flujo muestran una morfología y características de digestión diferentes a las de los coágulos formados estáticamente. Estos factores a menudo no están representados en los ensayos convencionales de digestión de coágulos in vitro , lo que puede tener implicaciones farmacológicas que afectan las tasas de éxito de la traducción de fármacos.
El ensayo Real-T ime Fluorometric Flowing Fibrinólisis (RT-FluFF) se desarrolló como una plataforma de pruebas de trombólisis de alta fidelidad que utiliza coágulos marcados con fluorescencia formados bajo flujo de cizallamiento, que luego se digieren utilizando plasma circulante en presencia o ausencia de agentes farmacéuticos fibrinolíticos. La modificación de las tasas de flujo de las etapas de formación y digestión de coágulos permite que el sistema imite las condiciones arteriales, pulmonares y venosas en configuraciones experimentales muy diversas. Las mediciones se pueden realizar de forma continua utilizando un fluorímetro en línea o tomando puntos de tiempo discretos, así como una medición convencional de la masa del coágulo en el punto final. El ensayo RT-FluFF es un sistema flexible que permite el seguimiento en tiempo real de la digestión de coágulos en condiciones de flujo que representan con mayor precisión las condiciones fisiológicas in vivo, al tiempo que conserva el control y la reproducibilidad de un sistema de pruebas in vitro.
Introduction
Las enfermedades derivadas fundamentalmente de etiologías tromboembólicas presentan una fuente importante de morbilidad y mortalidad en la sociedad actual. Las manifestaciones de la patogenia tromboembólica incluyen, entre otras, infartos de miocardio, accidentes cerebrovasculares isquémicos, trombosis venosas profundas y embolias pulmonares1. Una enorme cantidad de investigación en curso, que abarca múltiples disciplinas, gira en torno al desarrollo de métodos seguros y eficaces para tratar la trombosis patógena. Las variaciones en las manifestaciones arteriales y venosas de la trombosis y las diferentes localizaciones anatómicas han dado lugar al desarrollo de diferentes enfoques de tratamiento. Sin embargo, el tratamiento agudo generalmente se basa en el uso de trombólisis farmacológica a través de activadores del plasminógeno con el potencial de trombectomía mecánica en ciertas circunstancias clínicas2.
El desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento farmacológico se basa fundamentalmente tanto en modelos animales in vivo como en modelos de digestión in vitro para ensayos preclínicos 3,4. Los modelos in vivo se benefician naturalmente de su capacidad para capturar la compleja interacción de varios parámetros fisiológicos en la eficacia del tratamiento, que incluyen la eliminación de agentes farmacéuticos, así como las interacciones celulares con los fármacos. Sin embargo, esta misma complejidad a menudo hace que estos modelos sean bastante costosos e introduce problemas adicionales cuando se intenta aislar la farmacodinámica/cinética subyacente en animales que difieren significativamente de la fisiología humana. El desarrollo de modelos in vitro ha ayudado al facilitar un entorno de prueba destilado en el que se puede realizar el desarrollo y la detección de fármacos, pero a menudo carece de la fidelidad necesaria para recapitular el estado de la enfermedad que se está estudiando.
Los protocolos in vitro comúnmente encontrados para probar nuevos trombolíticos se basan en la utilización de coágulos formados y lisados en condiciones estáticas, en las que la masa residual del coágulo sirve como criterio de valoración primario 5,6. Desafortunadamente, estas técnicas no tienen en cuenta los aspectos mecánicos de la lisis de coágulos, como el flujo turbulento y las caídas de presión transtrombos, que pueden alterar significativamente la farmacodinámica de los fármacos de prueba. Además, los coágulos formados en condiciones estáticas contienen una microarquitectura que difiere de los coágulos fisiológicos. Se ha demostrado de manera reproducible que la presencia de cizallamiento durante la formación de coágulos afecta las características del coágulo resultante, como la activación plaquetaria y la reticulación de fibrina. Los coágulos que se producen bajo el flujo de cizallamiento exhiben una heterogeneidad compleja desde la punta hasta la cola que está ausente en los coágulos formados estáticamente 7,8. Tales desviaciones de la arquitectura fisiológica del coágulo pueden afectar a una importante caracterización del desarrollo de fármacos que incluye la penetración del fármaco dentro de un trombo y la posterior eficiencia de la lisis9.
Para abordar algunas de estas limitaciones asociadas con el uso de modelos estáticos de coagulación/lisis de coágulos, la adopción del bucle de Chandler tanto para la formación de coágulos como para la lisis de coágulos en presencia de cizallamiento ha experimentado un resurgimiento10. Aunque estos sistemas permiten una mejor representación de la dinámica de flujo y generan coágulos con una arquitectura fisiológicamente más relevante en comparación con los ensayos relativamente estáticos, sus condiciones de flujo simplificadas siguen representando una desviación de las condiciones fisiológicas. Por último, también se han llevado a cabo abordajes microfluídicos debido a su facilidad de obtención de imágenes y patrones de flujo uniformes; Sin embargo, siguen siendo una remoción significativa de las condiciones fisiológicas esperadas dentro de los vasos más grandes afectados principalmente en la mayoría de los trastornos tromboembólicos clínicamente relevantes11,12.
Teniendo en cuenta la discusión anterior, desarrollamos un modelo de trombólisis in vitro de alta fidelidad para el cribado preclínico de fármacos trombolíticos. El modelo tiene como objetivo abordar algunos de los escollos actuales detallados anteriormente en el ámbito del cribado de nuevas terapias trombolíticas y se validó la reproducibilidad y la sensibilidad a diferentes concentraciones del activador tisular del plasminógeno (tPA). El sistema descrito en este documento ofrece flujos de cizallamiento fisiológicos que utilizan una bomba peristáltica, un amortiguador de presión, un depósito calentado, dos sensores de presión, un fluorómetro en línea y un análogo de coágulo formado por cizallamiento en bucle de Chandler marcado con fluorescencia para facilitar el seguimiento en tiempo real de la fibrinólisis13. En conjunto, el sistema general se denomina ensayo de fibrinólisis fluorométrica de flujo en tiempo real (ensayo RT-FluFF)14 y este manuscrito analizará las complejidades de la configuración y ejecución exitosas de ensayos en este modelo de trombólisis in vitro de alta fidelidad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Formación de coágulos y etiquetado
Se ha demostrado que el asa de Chandler proporciona un medio fácil y eficaz para generar coágulos de forma reproducible que imitan los trombos in vivo 16. Los parámetros de ajuste fino, como el tamaño del tubo, las velocidades de rotación, el diámetro del tambor y el tiempo de coagulación, permiten la rápida generación de coágulos en diferentes condiciones de cizallamiento que pueden capturar las características arquitect…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación reportada en esta publicación fue respaldada por el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Premio Número R01HL167877. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| 30 G Disposable Hypodermic Needles | Exel International | 26439 | Other Consumables |
| 6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long | uxcell | B07SXGSQ82 | Chandler loop, |
| 96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate | Corning | 3635 | Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile |
| Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes | Air-Tite | MLB3 | RT-FluFF Apparatus , dampeners |
| Arium Mini Plus Ultrapure Water System | Sartorius | NA | DI water source |
| Calcium Chloride | Millipore Sigma | C5670 | Other Consumables |
| Disposable BP Transducers | AD Instruments | MLT0670 | RT-FluFF Apparatus |
| Drager Siemans HemoMed Pod | Drager | 5588822 | RT-FluFF Apparatus |
| Drager Siemans Patient Monitor | Drager | SC 7000 | RT-FluFF Apparatus |
| Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm) | Chandler loop, | ||
| Face Shield | Moxe | SHIELDS10 | Chandler loop, |
| Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Scientific | F13191 | Other Consumables |
| Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile | Masterflex | 30600-04 | RT-FluFF Apparatus |
| Fluorescein (FITC) | Thermo Scientific | 119245000 | Other Consumables |
| General-Purpose Water Bath | Thermo Scientific | 2839 | Chandler loop, |
| Hotplate 4 × 4 | Fisher Scientific | 1152016H | RT-FluFF Apparatus |
| Human Source Plasma Fresh-Frozen | Zen-Bio | SER-SPL | Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant |
| Human Whole Blood | Zen-Bio | SER-WB-SDS | Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant |
| L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor | Masterflex | 77200-62 | RT-FluFF Apparatus, Pump Head |
| L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC | Masterflex | 7528-10 | RT-FluFF Apparatus, Pump |
| Motor Speed Controller | CoCocina | ZK-MG | Chandler loop, |
| Nalgene Tubing T-Type Connectors | Thermo Scientific | 6151-0312 | RT-FluFF Apparatus |
| Peristaltic pump tubing | Masterflex | 06424-15 | Other Consumables |
| Phosphate buffered saline | Millipore Sigma | P3813 | Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system (or other fluorescence detection) | Molecular Devices | M5 | RT-FluFF Apparatus |
| Switching Power Supply | SoulBay | UC03U | Chandler loop, |
| Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL | Thermo Scientific | S751010 | Other Consumables |
| Tissue plasminogen activator, human | Millipore Sigma | T0831 | Other Consumables |
| Tubing ID 1/4'', OD 3/8'' | Fisher Scientific | AGL00017 | Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors |
| Tubing ID 5/32", OD 7/32" | Tygon | ND-100-65, ADF 00009 | Other Consumables |
| V3 365 nm Mini – Black Light UV Flashlight | uvBeast | uvB-V3-365-MINI | Chandler loop, used to check completed clots |
| ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm | Pangyoo | ZGA37RG | Chandler loop, |
References
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