Onthullen van het ferroptomatische fenotype van medulloblastoom
Summary
Het gehalte aan lipidehydroperoxide is de meest gebruikte indicator van ferroptotische celdood. Dit artikel demonstreert de stapsgewijze flowcytometrieanalyse van het lipidehydroperoxidegehalte in cellen bij ferroptose-inductie.
Abstract
De interactie van ijzer en zuurstof is een integraal onderdeel van de ontwikkeling van het leven op aarde. Desalniettemin blijft deze unieke chemie fascineren en puzzelen, wat leidt tot nieuwe biologische ondernemingen. In 2012 erkende een groep van de Columbia University deze interactie als een centrale gebeurtenis die leidde tot een nieuw type gereguleerde celdood genaamd ‘ferroptose’. Het belangrijkste kenmerk van ferroptose is de ophoping van lipidehydroperoxiden als gevolg van (1) disfunctionele antioxidantafweer en/of (2) overweldigende oxidatieve stress, die meestal samenvalt met een verhoogd gehalte aan vrij labiel ijzer in de cel. Dit wordt normaal gesproken voorkomen door de canonieke anti-ferroptotische as bestaande uit de cystinetransporter xCT, glutathion (GSH) en GSH-peroxidase 4 (GPx4). Aangezien ferroptose geen geprogrammeerd type celdood is, zijn er geen signaalroutes betrokken die kenmerkend zijn voor apoptose. De meest gebruikelijke manier om dit type celdood te bewijzen, is door lipofiele antioxidanten (vitamine E, ferrostatine-1, enz.) te gebruiken om dit te voorkomen. Deze moleculen kunnen oxidatieve schade in het plasmamembraan benaderen en ontgiften. Een ander belangrijk aspect bij het onthullen van het ferroptotische fenotype is het detecteren van de voorafgaande accumulatie van lipidehydroperoxiden, waarvoor de specifieke kleurstof BODIPY C11 wordt gebruikt. Het huidige manuscript zal laten zien hoe ferroptose kan worden geïnduceerd in wild-type medulloblastoomcellen door verschillende inductoren te gebruiken: erastine, RSL3 en ijzerdonor. Evenzo zullen de xCT-KO-cellen worden gebruikt die groeien in aanwezigheid van NAC en die ferroptose ondergaan nadat NAC is verwijderd. Het kenmerkende “borrelende” fenotype is zichtbaar onder de lichtmicroscoop binnen 12-16 uur vanaf het moment van ferroptose triggering. Verder zal BODIPY C11-kleuring gevolgd door FACS-analyse worden gebruikt om de accumulatie van lipidehydroperoxiden en de daaruit voortvloeiende celdood aan te tonen met behulp van de PI-kleuringsmethode. Om de ferroptotische aard van celdood aan te tonen, zal ferrostatine-1 worden gebruikt als een specifiek middel om ferroptose te voorkomen.
Introduction
Ferroptose is een nieuw gecontextualiseerde, reactieve zuurstofspecies (ROS)-afhankelijke vorm van celdood1. Naast ROS speelt ijzer een cruciale rol(len) bij deze vorm van celdood, vandaar de naam2. De laatste en uitvoerende stap van ferroptose is de door ijzer gekatalyseerde accumulatie van oxidatieve schade van lipiden in het plasmamembraan die uiteindelijk leidt tot aangetaste membraanintegriteit en selectieve permeabiliteit, en ten slotte tot celdood door borrelen. Lipide hydroperoxidatie is een natuurlijk voorkomend fenomeen; De voortplanting ervan door het celmembraan wordt echter voorkomen door de antioxidantverdediging van de cel. De belangrijkste speler in deze context is Se-eiwit glutathionperoxidase 4 (GPx4), dat het membraan kan benaderen en lipidehydroperoxiden kan omzetten in hun minder giftige alcoholderivaten3. Het reducerend vermogen voor GPx4 wordt voornamelijk, maar niet uitsluitend, geleverd door glutathion (GSH), een tripeptide dat is samengesteld uit de niet-essentiële aminozuren: glycine, glutamaat en cysteïne. Het snelheidsbeperkende aminozuur voor de biosynthese van GSH is cysteïne4. Hoewel cysteïne is geclassificeerd als een niet-essentieel aminozuur, kunnen de behoeften ervan gemakkelijk groter zijn dan de interne productie in zeer proliferatieve cellen (zoals kankercellen). Het is dus opnieuw geclassificeerd in de groep van semi-essentiële aminozuren. De noodzakelijke import van cysteïne gebeurt voornamelijk via het Xc-systeem, dat de import van de geoxideerde (dominante) vorm van cysteïne (ook wel cystine genoemd) mogelijk maakt ten koste van de glutamaatexport5. Het Xc-systeem bestaat uit een Na+-onafhankelijke, Cl-afhankelijke transportsubeenheid, bekend als xCT, en een chaperon-subeenheid, bekend als CD98. Tot voor kort werden de anti-ferroptotische eigenschappen van de xCT-GSH-GPx4-as als uniek en onnavolgbaar beschouwd6. In 2019 is echter een alternatieve anti-ferroptotische route, bestaande uit ubiquinol (co-enzym Q10) en zijn regeneratieve enzym – ferroptose-suppressoreiwit 1 (FSP1), beschreven 7,8. Kort daarna is nog een ander lipidehydroperoxide-ontgiftingssysteem met GTP-cyclohydrolase-1/tetrahydrobiopterine (GCH1/BH4) gemeld9. Desalniettemin lijkt de centrale rol van de xCT-GSH-GPx4-as bij de preventie van ferroptose niet te worden betwist.
In het afgelopen decennium is ferroptose uitgebreid bestudeerd in een verscheidenheid aan tumortypes, wat een groot potentieel heeft aangetoond als een antikankerstrategie (beoordeeld door Lei et al.10). Bovendien is gemeld dat kankercellen die een hoge resistentie vertonen tegen conventionele chemotherapeutica en/of een neiging hebben om uit te zaaien, verrassend gevoelig zijn voor ferroptose-inductoren, zoals remmers van GPx4 11,12,13. In de context van hersentumoren blijft het potentieel van ferroptotische inductoren echter grotendeels onderbelicht. Hoewel dit type celdood nauw in verband is gebracht met cerebrale ischemie-reperfusieletsel14en neurodegeneratieve ziekten15, is het potentieel ervan in de context van hersentumoren voornamelijk beperkt tot glioblastoom, de meest voorkomende kwaadaardige craniocerebrale tumor (beoordeeld door Zhuo et al.16). Aan de andere kant blijft de gevoeligheid van medulloblastoom, de meest voorkomende kwaadaardige hersentumor bij kinderen en een belangrijke oorzaak van kindersterfte, voor ferroptose-inductoren grotendeels onontgonnen. Voor zover wij weten, is er schaarse peer-reviewed literatuur die ferroptose en medulloblastoom met elkaar in verband brengt. Desalniettemin hebben sommige onderzoeken aangetoond dat ijzer een cruciale rol speelt bij de overleving, proliferatie en tumorigene potentie van zowel medulloblastoom als glioblastoom kankerstamcellen (CSC’s)17,18, waardoor ze mogelijk kwetsbaarder worden voor ferroptose-inductie. Dit is vooral belangrijk omdat medulloblastoom berucht is om zijn subpopulatie van CSC’s, of tumor-initiërende/zich voortplantende cellen, die grotendeels verantwoordelijk lijken te zijn voor tumorchemoresistentie, verspreiding en terugval19.
Gevoeligheid voor ferroptose-inductie wordt meestal onderzocht door het gehalte/de accumulatie van lipidehydroperoxide te meten, wat al dan niet tot celdood kan leiden. De meest gebruikte feroptose-inductoren zijn (1) erastine, een remmer van de xCT-transporter20, (2) RSL3, een remmer van het GPx4-enzym2, en/of (3) ijzerdonoren, zoals ferro-ammoniumcitraat (FAC)21. Het lipidehydroperoxidegehalte wordt beoordeeld met behulp van de selectieve sonde BODIPY 581/591 C1122, die in gereduceerde toestand excitatie- en emissiemaxima heeft bij 581/591 nm. Bij interactie met en oxidatie door lipidehydroperoxiden verschuift de sonde zijn excitatie- en emissiemaxima naar 488/510 nm. Doorgaans gaat een significante toename van het lipidehydroperoxidegehalte vooraf aan ferroptotische celdood. Aangezien ferroptose geen geprogrammeerde celdood is, is er geen moleculaire signaalcascade die leidt tot de uitvoering ervan. Daarom is de enige manier om dit te bevestigen, het lipidehydroperoxidegehalte te controleren en specifieke remmers te gebruiken voor dit type celdood, zoals ferrostatine 123. Ferrostatine 1 is een lipofiele antioxidant die het lipidencompartiment van de cel kan binnendringen en lipidehydroperoxiden kan ontgiften, waardoor ferroptotische gebeurtenissen worden voorkomen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het primaire kenmerk van ferroptotische celdood is de ongecontroleerde ophoping van lipidehydroperoxiden in het plasmamembraan. Deze oxidatieve schade kan op een enzymatische of niet-enzymatische manier optreden, maar in beide gevallen is de reactie ijzerafhankelijk/gekatalyseerd, wat de naam van dit type celdood verklaart. Lipidehydroperoxidatie wordt vaak indirect geschat door de afbraakproducten van lipidehydroperoxidatie te meten, zoals 4-hydroxy-2,3-trans-nonenal (4-HNE) of malonaldehyde (MDA). Deze producten, gegen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de regering van het Prinsdom Monaco, maar ook door ‘Le Groupement des Entreprises Monégasques dans la Lutte contre le cancer’ (GEMLUC) en de Flavien Foundation, die de middelen ter beschikking stelde voor de aankoop van BD FACS Melody.
Materials
| BODIPY 581/591 C11 | Thermo Fisher | D3861 | |
| Cell counter | Beckman | Coulter Z1 | |
| DMEM medium | Gibco | 10569010 | |
| Erastin | Sigma-Aldrich | E7781-5MG | |
| Ferroamminium citrate | Acros Organics | 211842500 | |
| Ferrostatin-1 | Sigma-Aldrich | SML0583-25MG | |
| Fetal bovin serum (FBS) | Dominique Dutcher | 500105N1N | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Melody | |
| Gibco StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher | 11599686 | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| PlasmoTest Mycoplasma Detection Kit | InvivoGen | rep-pt1 | |
| propidium iodide | Invitrogen | P3566 | |
| RSL3 | Sigma-Aldrich | SML2234-25MG | |
| Trypsin – EDTA 10X – 100 mL | Dominique Dutcher | X0930-100 |
References
- Dixon, S. J., et al. Ferroptosis: An iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 149, 1060-1072 (2012).
- Yang, W. S., Stockwell, B. R. Synthetic lethal screening identifies compounds activating iron-dependent, nonapoptotic cell death in oncogenic-ras-harboring cancer cells. Chem Biol. 15 (30), 234-245 (2008).
- Yang, W. S., et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4. Cell. 156, 317-331 (2014).
- Meister, A., Anderson, M. E. Glutathione. Annu Rev Biochem. 52, 711-760 (1983).
- Lewerenzm, J., et al. The cystine/glutamate antiporter system xc- in health and disease: From molecular mechanisms to novel therapeutic opportunities. Antioxid Redox Signal. 18 (5), 522-555 (2013).
- Yang, W. S., et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4. Cell. 156, 317-331 (2014).
- Bersuker, K., et al. The CoQ oxidoreductase FSP1 acts parallel to GPX4 to inhibit ferroptosis. Nature. 575, 688-692 (2019).
- Doll, S., et al. FSP1 is a glutathione-independent ferroptosis suppressor. Nature. 575, 693-698 (2019).
- Hu, Q., et al. Blockade of GCH1/BH4 axis activates ferritinophagy to mitigate the resistance of colorectal cancer to erastin-induced ferroptosis. Front Cell Dev Biol. 10, (2022).
- Lei, G., Zhuang, L., Gan, B. Targeting ferroptosis as a vulnerability in cancer. Nat Rev Cancer. 22, 381-396 (2022).
- Viswanathan, V. S., et al. Dependency of a therapy-resistant state of cancer cells on a lipid peroxidase pathway. Nature. 547, 453-457 (2017).
- Lee, J., You, J. H., Kim, M. S., Roh, J. L. Epigenetic reprogramming of epithelial-mesenchymal transition promotes ferroptosis of head and neck cancer. Redox Biol. 37, 101697 (2020).
- Hangauer, M. J., et al. Drug-tolerant persister cancer cells are vulnerable to GPX4 inhibition. Nature. 551, 247-250 (2017).
- Zhang Tuo, Q., et al. Thrombin induces ACSL4-dependent ferroptosis during cerebral ischemia/reperfusion. Signal Transduct Target Ther. 7, 59 (2022).
- Sun, Y. Mechanisms of ferroptosis and emerging links to the pathology of neurodegenerative diseases. Front Aging Neurosci. 14, (2022).
- Zhuo, S. Emerging role of ferroptosis in glioblastoma: Therapeutic opportunities and challenges. Front Mol Biosci. 9, (2022).
- Bisaro, B. Proteomic analysis of extracellular vesicles from medullospheres reveals a role for iron in the cancer progression of medulloblastoma. Mol Cell Ther. 3, 8 (2015).
- Schonberg, D. L., et al. Preferential iron trafficking characterizes glioblastoma stem-like cells. Cancer Cell. 28 (4), 441-455 (2015).
- Werbowetski-Ogilvie, T. E. From sorting to sequencing in the molecular era: the evolution of the cancer stem cell model in medulloblastoma. FEBS J. 289 (7), 1765-1778 (2022).
- Dixon, S. J. Pharmacological inhibition of cystine-glutamate exchange induces endoplasmic reticulum stress and ferroptosis. Elife. 3, e02523 (2014).
- Bauckman, K. A., Haller, E., Flores, I., Nanjundan, M. Iron modulates cell survival in a Ras- and MAPK-dependent manner in ovarian cells. Cell Death Dis. 4, e592 (2013).
- Drummen, G. P. C., Van Liebergen, L. C., Op den Kamp, J. A. F., Post, J. A. C11-BODIPY581/591, an oxidation-sensitive fluorescent lipid peroxidation probe: (Micro)spectroscopic characterization and validation of methodology. Free Radic Biol Med. 33 (4), 473-490 (2002).
- Miotto, G. Insight into the mechanism of ferroptosis inhibition by ferrostatin-1. Redox Biol. 28, 101328 (2020).
- Daher, B. Genetic ablation of the cystine transporter xCT in PDAC cells inhibits mTORC1, growth, survival, and tumor formation via nutrient and oxidative stresses. Cancer Res. 79 (15), 3877-3890 (2019).
- Shimada, K. Global survey of cell death mechanisms reveals metabolic regulation of ferroptosis. Nat Chem Biol. 12, 497-503 (2016).
- Yang, W. S. Peroxidation of polyunsaturated fatty acids by lipoxygenases drives ferroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), E4966-E4975 (2016).
- Gaschler, M. M. FINO2 initiates ferroptosis through GPX4 inactivation and iron oxidation. Nat Chem Biol. 14, 507-515 (2018).
- Bogacz, M., Krauth-Siegel, R. L. Tryparedoxin peroxidase-deficiency commits trypanosomes to ferroptosis-type cell death. Elife. 7, e37503 (2018).
- Cheloni, G., Slaveykova, V. I. Optimization of the C11-BODIPY581/591 dye for the determination of lipid oxidation in Chlamydomonas reinhardtii by flow cytometry. Cytom Part A. 83 (10), 952-961 (2013).
- Itoh, N., Cao, J., Chen, Z. H., Yoshida, Y., Niki, E. Advantages and limitation of BODIPY as a probe for the evaluation of lipid peroxidation and its inhibition by antioxidants in plasma. Bioorganic Med Chem Lett. 17 (7), 2059-2063 (2007).
- Sato, M., et al. The ferroptosis inducer erastin irreversibly inhibits system xc− and synergizes with cisplatin to increase cisplatin’s cytotoxicity in cancer cells. Sci Rep. 8, 968 (2018).
- Cheff, D. M., et al. The ferroptosis inducing compounds RSL3 and ML162 are not direct inhibitors of GPX4 but of TXNRD1. Redox Biol. 62, 102703 (2023).
- Wang, C., et al. Dual degradation mechanism of GPX4 degrader in induction of ferroptosis exerting anti-resistant tumor effect. Eur J Med Chem. 247, 115072 (2023).
- Vucetic, M., et al. Together we stand, apart we fall: how cell-to-cell contact/interplay provides resistance to ferroptosis. Cell Death Dis. 11, 789 (2020).
- Meira, W., et al. A cystine-cysteine intercellular shuttle prevents ferroptosis in xctko pancreatic ductal adenocarcinoma cells. Cancers (Basel). 13 (6), 1434 (2021).
.