수모세포종(Medulloblastoma)의 페롭토시스 표현형(Ferroptotic Phenotype) 밝혀짐
Summary
지질 하이드로퍼옥사이드 함량은 페롭토틱 세포 사멸의 가장 일반적으로 사용되는 지표를 나타냅니다. 이 기사는 페롭토시스 유도 시 세포의 지질 하이드로퍼옥사이드 함량에 대한 단계별 유세포 분석을 보여줍니다.
Abstract
철과 산소의 상호 작용은 지구상의 생명 발달에 필수적인 부분입니다. 그럼에도 불구하고 이 독특한 화학 물질은 계속해서 매혹적이고 당혹스러워하며 새로운 생물학적 모험으로 이어지고 있습니다. 2012년, 컬럼비아 대학의 한 연구팀은 이러한 상호작용을 “페롭토시스(ferroptosis)”라는 새로운 유형의 조절 세포 사멸로 이끄는 중심 사건으로 인식했습니다. 페롭토시스의 주요 특징은 (1) 항산화 방어 기능 장애 및/또는 (2) 압도적인 산화 스트레스로 인한 지질 하이드로퍼옥사이드의 축적이며, 이는 세포 내 유리 불안정한 철 함량 증가와 가장 빈번하게 일치합니다. 이는 일반적으로 시스틴 수송체 xCT, 글루타티온(GSH) 및 GSH 퍼옥시다제 4(GPx4)로 구성된 표준 항페롭토틱 축에 의해 방지됩니다. 페롭토시스(ferroptosis)는 프로그래밍된 유형의 세포 사멸이 아니기 때문에 세포사멸(apoptosis)의 특징적인 신호 전달 경로를 포함하지 않습니다. 이러한 유형의 세포 사멸을 증명하는 가장 일반적인 방법은 친유성 항산화제(비타민 E, 페로스타틴-1 등)를 사용하여 예방하는 것입니다. 이 분자는 원형질막의 산화 손상에 접근하여 해독할 수 있습니다. 페롭토틱 표현형을 밝히는 또 다른 중요한 측면은 특정 염료 BODIPY C11이 사용되는 지질 하이드로퍼옥사이드의 선행 축적을 검출하는 것입니다. 본 논문은 야생형 수모세포종 세포에서 에라스틴(erastin), RSL3, 철 공여체(iron-donor) 등 다양한 유도 인자를 사용하여 페롭토시스(ferroptosis)를 유도하는 방법을 보여줍니다. 마찬가지로, NAC가 있는 곳에서 성장하고 NAC가 제거된 후 페롭토시스(ferroptosis)를 겪는 xCT-KO 세포가 사용됩니다. 특징적인 “버블링(bubbling)” 표현형은 페롭토시스(ferroptosis)가 촉발되는 순간으로부터 12-16시간 이내에 광학 현미경으로 볼 수 있습니다. 또한 BODIPY C11 염색 후 FACS 분석을 통해 PI 염색법을 사용하여 지질 하이드로퍼옥사이드의 축적과 그에 따른 세포 사멸을 보여줍니다. 세포 사멸의 페롭토시스 특성을 입증하기 위해 페로스타틴-1은 특정 페롭토시스 예방제로 사용될 것입니다.
Introduction
페롭토시스(Ferroptosis)는 새롭게 맥락화된 활성산소종(ROS) 의존적 유형의 세포 사멸이다1. ROS 외에도 철은 이러한 유형의 세포 사멸에서 중요한 역할을 하므로2라는 이름이 붙었습니다. 페롭토시스(ferroptosis)의 마지막 단계는 원형질막에서 지질의 산화적 손상이 철 촉매로 축적되는 것으로, 이는 결국 막의 무결성 손상과 선택적 투과성, 그리고 마지막으로 기포에 의한 세포 사멸로 이어집니다. 지질 하이드로퍼옥시드 현상은 자연적으로 발생하는 현상입니다. 그러나 세포막을 통한 증식은 세포의 항산화 방어에 의해 방지됩니다. 이러한 맥락에서 주요 역할을 하는 것은 Se-protein glutathione peroxidase 4 (GPx4)로, 막에 접근하여 지질 하이드로퍼옥사이드를 독성이 덜한 알코올 유도체로 전환할 수 있습니다3. GPx4의 환원력은 주로 비필수 아미노산인 글리신, 글루타메이트, 시스테인으로 구성된 트리펩타이드인 글루타치온(GSH)에 의해 제공되지만 배타적이지는 않습니다. GSH의 생합성을 위한 속도 제한 아미노산은 시스테인4입니다. 시스테인은 비필수 아미노산으로 분류되지만, 그 요구량은 증식성이 높은 세포(예: 암세포)에서 내부 생성을 쉽게 초과할 수 있습니다. 따라서 그것은 semi-essential 아미노산 그룹으로 재분류되었습니다. 시스테인의 필요한 수입은 주로 Xc- 시스템을 통해 발생하며, 이는 글루타메이트 수출을 희생하면서 산화된(우성) 형태의 시스테인(일명 시스틴)을 수입할 수 있게 해준다5. Xc- 시스템은 xCT로 알려진 Na+-독립, Cl–종속 수송 소단위와 CD98로 알려진 샤페론 소단위로 구성됩니다. 최근까지 xCT-GSH-GPx4 축의 반-페롭토틱 특성은 독특하고 복제할 수 없는 것으로 여겨져 왔다6. 그러나 2019년에는 유비퀴놀(코엔자임 Q10)과 그 재생 효소인 페롭토시스 억제 단백질 1(FSP1)로 구성된 대체 항페롭토틱 경로가 설명되었습니다 7,8. 그 직후, GTP 사이클로하이드로라제-1/테트라하이드로바이오프테린(GCH1/BH4)과 관련된 또 다른 지질 하이드로퍼옥사이드 해독 시스템이 보고되었다9. 그럼에도 불구하고 페롭토시스 예방에서 xCT-GSH-GPx4 축의 중심적인 역할은 도전받지 않는 것으로 보입니다.
지난 10년 동안 페롭토시스는 다양한 종양 유형에서 광범위하게 연구되어 항암 전략으로서 큰 잠재력을 보여주었습니다(Lei et al.10 검토). 또한, 기존의 화학요법제에 대한 저항성이 높거나 전이 성향을 보이는 암세포는 GPx4 11,12,13 억제제와 같은 페롭토시스 유도제에 놀라울 정도로 민감하다는 보고가 있었습니다. 그러나 뇌종양의 맥락에서 페롭토시스 유도제의 잠재력은 대체로 연구가 부족한 상태로 남아 있습니다. 이러한 유형의 세포 사멸은 대뇌 허혈-재관류 손상(cerebral ischemia-refusion injury)14및 신경퇴행성 질환(neurodegenerativediseases)15과 밀접한 관련이 있지만, 뇌종양의 맥락에서 그 잠재력은 주로 가장 흔한 악성 두개뇌 종양인 교모세포종(glioblastoma)에 국한되어 있다(Zhuo et al.16에 의해 검토됨). 한편, 가장 흔한 악성 소아 뇌종양이자 소아 사망률의 주요 원인인 수모세포종(medulloblastoma)이 페롭토시스 유발인자에 대한 민감성은 대부분 연구되지 않은 상태로 남아 있습니다. 우리가 아는 한, 페롭토시스와 수모세포종을 연결하는 동료 심사 문헌은 거의 없습니다. 그럼에도 불구하고 일부 연구에서는 철분이 수모세포종과 교모세포종 암 줄기 세포(CSC)의 생존, 증식 및 종양 생성 가능성에 중요한 역할을 한다는 것을 밝혀냈습니다.17,18 이로 인해 페롭토시스 유도에 더 취약해질 수 있습니다. 이는 수모세포종(medulloblastoma)이 종양 화학저항성, 전파 및 재발의 주요 원인이 되는 것으로 보이는 CSC(tumor-initiating/propagating cells)의 하위 집단으로 악명이 높기 때문에 특히 중요하다19.
페롭토시스 유도에 대한 민감도는 일반적으로 세포 사멸로 이어질 수 있거나 그렇지 않을 수 있는 지질 하이드로퍼옥사이드 함량/축적을 측정하여 조사합니다. 가장 일반적으로 사용되는 페롭토시스 유도제는 (1) xCT 수송체20의 억제제인 에라스틴, (2) GPx4 효소2의 억제제인 RSL3 및/또는 (3) 구연산제철암모늄(FAC)21과 같은 철 공여체입니다. 지질 하이드로퍼옥사이드 함량은 선택적 프로브 BODIPY 581/591 C1122를 사용하여 평가하며, 이 프로브는 감소된 상태에서 581/591nm에서 여기 및 방출 최대값을 갖습니다. 지질 하이드로퍼옥사이드와의 상호 작용 및 산화에 의해 산화되면 프로브는 여기 및 방출 최대값을 488/510nm로 이동합니다. 전형적으로, 지질 하이드로퍼옥사이드 함량의 현저한 증가는 페롭토틱 세포 사멸에 선행합니다. 페롭토시스는 프로그래밍된 세포 사멸이 아니기 때문에 페롭토시스 실행으로 이어지는 분자 신호 전달 캐스케이드가 없습니다. 따라서 이를 확인할 수 있는 유일한 방법은 지질 하이드로퍼옥사이드 함량을 모니터링하고 이러한 유형의 세포 사멸에 대해 페로스타틴 123과 같은 특정 억제제를 사용하는 것입니다. 페로스타틴 1은 세포의 지질 구획에 침투하여 지질 하이드로퍼옥사이드를 해독하여 페롭토시스 사건을 예방할 수 있는 친유성 항산화제입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
ferroptotic cell death의 주요 특징은 원형질막에 지질 하이드로퍼옥사이드가 통제되지 않고 축적된다는 것입니다. 이러한 산화적 손상은 효소 또는 비효소 방식으로 발생할 수 있지만, 두 경우 모두 반응은 철 의존적/촉매 작용을 통해 발생하며, 이는 이러한 유형의 세포 사멸의 이름을 설명합니다. 지질 하이드로퍼옥데이션은 종종 4-하이드록시-2,3-트랜스-노네날(4-HNE) 또는 말론알데히드(MDA)와 같은 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 모나코 공국 정부, ‘Le Groupement des Entreprises Monégasques dans la Lutte contre le cancer'(GEMLUC) 및 BD FACS Melody 구매 수단을 제공한 Flavien Foundation의 지원을 받았습니다.
Materials
| BODIPY 581/591 C11 | Thermo Fisher | D3861 | |
| Cell counter | Beckman | Coulter Z1 | |
| DMEM medium | Gibco | 10569010 | |
| Erastin | Sigma-Aldrich | E7781-5MG | |
| Ferroamminium citrate | Acros Organics | 211842500 | |
| Ferrostatin-1 | Sigma-Aldrich | SML0583-25MG | |
| Fetal bovin serum (FBS) | Dominique Dutcher | 500105N1N | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Melody | |
| Gibco StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher | 11599686 | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| PlasmoTest Mycoplasma Detection Kit | InvivoGen | rep-pt1 | |
| propidium iodide | Invitrogen | P3566 | |
| RSL3 | Sigma-Aldrich | SML2234-25MG | |
| Trypsin – EDTA 10X – 100 mL | Dominique Dutcher | X0930-100 |
References
- Dixon, S. J., et al. Ferroptosis: An iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 149, 1060-1072 (2012).
- Yang, W. S., Stockwell, B. R. Synthetic lethal screening identifies compounds activating iron-dependent, nonapoptotic cell death in oncogenic-ras-harboring cancer cells. Chem Biol. 15 (30), 234-245 (2008).
- Yang, W. S., et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4. Cell. 156, 317-331 (2014).
- Meister, A., Anderson, M. E. Glutathione. Annu Rev Biochem. 52, 711-760 (1983).
- Lewerenzm, J., et al. The cystine/glutamate antiporter system xc- in health and disease: From molecular mechanisms to novel therapeutic opportunities. Antioxid Redox Signal. 18 (5), 522-555 (2013).
- Yang, W. S., et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4. Cell. 156, 317-331 (2014).
- Bersuker, K., et al. The CoQ oxidoreductase FSP1 acts parallel to GPX4 to inhibit ferroptosis. Nature. 575, 688-692 (2019).
- Doll, S., et al. FSP1 is a glutathione-independent ferroptosis suppressor. Nature. 575, 693-698 (2019).
- Hu, Q., et al. Blockade of GCH1/BH4 axis activates ferritinophagy to mitigate the resistance of colorectal cancer to erastin-induced ferroptosis. Front Cell Dev Biol. 10, (2022).
- Lei, G., Zhuang, L., Gan, B. Targeting ferroptosis as a vulnerability in cancer. Nat Rev Cancer. 22, 381-396 (2022).
- Viswanathan, V. S., et al. Dependency of a therapy-resistant state of cancer cells on a lipid peroxidase pathway. Nature. 547, 453-457 (2017).
- Lee, J., You, J. H., Kim, M. S., Roh, J. L. Epigenetic reprogramming of epithelial-mesenchymal transition promotes ferroptosis of head and neck cancer. Redox Biol. 37, 101697 (2020).
- Hangauer, M. J., et al. Drug-tolerant persister cancer cells are vulnerable to GPX4 inhibition. Nature. 551, 247-250 (2017).
- Zhang Tuo, Q., et al. Thrombin induces ACSL4-dependent ferroptosis during cerebral ischemia/reperfusion. Signal Transduct Target Ther. 7, 59 (2022).
- Sun, Y. Mechanisms of ferroptosis and emerging links to the pathology of neurodegenerative diseases. Front Aging Neurosci. 14, (2022).
- Zhuo, S. Emerging role of ferroptosis in glioblastoma: Therapeutic opportunities and challenges. Front Mol Biosci. 9, (2022).
- Bisaro, B. Proteomic analysis of extracellular vesicles from medullospheres reveals a role for iron in the cancer progression of medulloblastoma. Mol Cell Ther. 3, 8 (2015).
- Schonberg, D. L., et al. Preferential iron trafficking characterizes glioblastoma stem-like cells. Cancer Cell. 28 (4), 441-455 (2015).
- Werbowetski-Ogilvie, T. E. From sorting to sequencing in the molecular era: the evolution of the cancer stem cell model in medulloblastoma. FEBS J. 289 (7), 1765-1778 (2022).
- Dixon, S. J. Pharmacological inhibition of cystine-glutamate exchange induces endoplasmic reticulum stress and ferroptosis. Elife. 3, e02523 (2014).
- Bauckman, K. A., Haller, E., Flores, I., Nanjundan, M. Iron modulates cell survival in a Ras- and MAPK-dependent manner in ovarian cells. Cell Death Dis. 4, e592 (2013).
- Drummen, G. P. C., Van Liebergen, L. C., Op den Kamp, J. A. F., Post, J. A. C11-BODIPY581/591, an oxidation-sensitive fluorescent lipid peroxidation probe: (Micro)spectroscopic characterization and validation of methodology. Free Radic Biol Med. 33 (4), 473-490 (2002).
- Miotto, G. Insight into the mechanism of ferroptosis inhibition by ferrostatin-1. Redox Biol. 28, 101328 (2020).
- Daher, B. Genetic ablation of the cystine transporter xCT in PDAC cells inhibits mTORC1, growth, survival, and tumor formation via nutrient and oxidative stresses. Cancer Res. 79 (15), 3877-3890 (2019).
- Shimada, K. Global survey of cell death mechanisms reveals metabolic regulation of ferroptosis. Nat Chem Biol. 12, 497-503 (2016).
- Yang, W. S. Peroxidation of polyunsaturated fatty acids by lipoxygenases drives ferroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), E4966-E4975 (2016).
- Gaschler, M. M. FINO2 initiates ferroptosis through GPX4 inactivation and iron oxidation. Nat Chem Biol. 14, 507-515 (2018).
- Bogacz, M., Krauth-Siegel, R. L. Tryparedoxin peroxidase-deficiency commits trypanosomes to ferroptosis-type cell death. Elife. 7, e37503 (2018).
- Cheloni, G., Slaveykova, V. I. Optimization of the C11-BODIPY581/591 dye for the determination of lipid oxidation in Chlamydomonas reinhardtii by flow cytometry. Cytom Part A. 83 (10), 952-961 (2013).
- Itoh, N., Cao, J., Chen, Z. H., Yoshida, Y., Niki, E. Advantages and limitation of BODIPY as a probe for the evaluation of lipid peroxidation and its inhibition by antioxidants in plasma. Bioorganic Med Chem Lett. 17 (7), 2059-2063 (2007).
- Sato, M., et al. The ferroptosis inducer erastin irreversibly inhibits system xc− and synergizes with cisplatin to increase cisplatin’s cytotoxicity in cancer cells. Sci Rep. 8, 968 (2018).
- Cheff, D. M., et al. The ferroptosis inducing compounds RSL3 and ML162 are not direct inhibitors of GPX4 but of TXNRD1. Redox Biol. 62, 102703 (2023).
- Wang, C., et al. Dual degradation mechanism of GPX4 degrader in induction of ferroptosis exerting anti-resistant tumor effect. Eur J Med Chem. 247, 115072 (2023).
- Vucetic, M., et al. Together we stand, apart we fall: how cell-to-cell contact/interplay provides resistance to ferroptosis. Cell Death Dis. 11, 789 (2020).
- Meira, W., et al. A cystine-cysteine intercellular shuttle prevents ferroptosis in xctko pancreatic ductal adenocarcinoma cells. Cancers (Basel). 13 (6), 1434 (2021).
.