Выявление ферроптотического фенотипа медуллобластомы

Summary

Содержание гидропероксида липидов является наиболее часто используемым индикатором гибели ферроптозных клеток. В данной статье представлен пошаговый анализ содержания гидропероксида липидов в клетках с помощью проточной цитометрии при индукции ферроптоза.

Abstract

Взаимодействие железа и кислорода является неотъемлемой частью развития жизни на Земле. Тем не менее, эта уникальная химия продолжает очаровывать и озадачивать, приводя к новым биологическим предприятиям. В 2012 году группа из Колумбийского университета признала это взаимодействие центральным событием, ведущим к новому типу регулируемой клеточной смерти, названному «ферроптозом». Основной особенностью ферроптоза является накопление гидропероксидов липидов вследствие (1) дисфункциональной антиоксидантной защиты и/или (2) подавляющего окислительного стресса, который чаще всего совпадает с повышенным содержанием свободного лабильного железа в клетке. Обычно это предотвращается канонической антиферроптозной осью, содержащей транспортер цистина xCT, глутатион (GSH) и пероксидазу GSH 4 (GPx4). Поскольку ферроптоз не является запрограммированным типом клеточной смерти, он не включает в себя сигнальные пути, характерные для апоптоза. Наиболее распространенным способом доказать этот тип клеточной смерти является использование липофильных антиоксидантов (витамин Е, ферростатин-1 и т.д.) для ее предотвращения. Эти молекулы могут приближаться к окислительному повреждению плазматической мембраны и выводить его из токсина. Другим важным аспектом в выявлении ферроптотического фенотипа является обнаружение предшествующего накопления гидропероксидов липидов, для чего используется специфический краситель BODIPY C11. В настоящей рукописи будет показано, как ферроптоз может быть индуцирован в клетках медуллобластомы дикого типа с помощью различных индукторов: эрантина, RSL3 и донора железа. Аналогичным образом, будут использоваться клетки xCT-KO, которые растут в присутствии NAC и которые подвергаются ферроптозу после удаления NAC. Характерный «пузырчатый» фенотип виден под световым микроскопом в течение 12-16 ч с момента запуска ферроптоза. Кроме того, будет использовано окрашивание BODIPY C11 с последующим анализом FACS, чтобы показать накопление гидропероксидов липидов и последующую гибель клеток с использованием метода окрашивания PI. Чтобы доказать ферроптотическую природу клеточной гибели, ферростатин-1 будет использоваться в качестве специфического средства, предотвращающего ферроптоз.

Introduction

Ферроптоз является новым контекстуализированным, зависимым от активных форм кислорода (АФК) типом клеточной смерти¹. Помимо АФК, железо играет решающую роль в этом типе клеточной смерти, отсюда и название². Заключительным и исполнительным этапом ферроптоза является катализируемое железом накопление окислительного повреждения липидов в плазматической мембране, что в конечном итоге приводит к нарушению целостности мембраны и селективной проницаемости и, наконец, к гибели клеток в результате барботирования. Событие гидроперекисного окисления липидов является естественным явлением; Однако его распространению по всей клеточной мембране препятствует антиоксидантная защита клетки. Основным игроком в этом контексте является Se-протеин глутатионпероксидаза 4 (GPx4), которая может приближаться к мембране и превращать гидропероксиды липидов в их менее токсичные производные алкоголя³. Восстановительная способность GPx4 в основном, но не исключительно, обеспечивается глутатионом (GSH), трипептидом, состоящим из заменимых аминокислот: глицина, глутамата и цистеина. Ограничивающей скорость аминокислотой для биосинтеза GSH является цистеин⁴. Хотя цистеин классифицируется как заменимая аминокислота, его потребности могут легко превышать его внутреннее производство в клетках с высокой степенью пролиферации (например, раковых клетках). Таким образом, он был реклассифицирован в группу полузаменимых аминокислот. Необходимый импорт цистеина происходит в основном через Xc-систему, которая позволяет импортировать окисленную (доминирующую) форму цистеина (он же цистин) за^{счет экспорта} глутамата5. Xc-система состоит из Na+-независимой, Cl-зависимой транспортной субъединицы, известной как xCT, и шаперонной субъединицы, известной как CD98. До недавнего времени антиферроптозные свойства оси xCT-GSH-GPx4 считались уникальными и невоспроизводимыми⁶. Однако в 2019 году^{был описан} альтернативный антиферроптозный путь, состоящий из убихинола (Coenzyme Q10) и его регенеративного фермента – белка-супрессора ферроптоза 1 (FSP1), ^7,8. Вскоре после этого сообщалось о еще одной системе детоксикации гидропероксида липидов, включающей циклогидролазу ГТФ-1/тетрагидробиоптерин (GCH1/BH4)⁹. Тем не менее, центральная роль оси xCT-GSH-GPx4 в профилактике ферроптоза, по-видимому, не оспаривается.

За последнее десятилетие ферроптоз широко изучался при различных типах опухолей, демонстрируя большой потенциал в качестве противораковой стратегии (обзор Lei et ^al.10). Кроме того, сообщалось, что раковые клетки, проявляющие высокую устойчивость к обычным химиотерапевтическим средствам и/или склонность к метастазированию, удивительно чувствительны к индукторам ферроптоза, таким как ингибиторы GPx4 11,12,13. Однако в контексте опухолей головного мозга потенциал ферроптозных индукторов остается в значительной степени малоизученным. В то время как этот тип клеточной гибели тесно связан с церебральной ишемией-реперфузионной травмой¹⁴и нейродегенеративными заболеваниями¹⁵, его потенциал в контексте опухолей головного мозга в основном ограничен глиобластомой, наиболее распространенной злокачественной черепно-мозговой опухолью (обзор Zhuo et ^al.16). С другой стороны, чувствительность медуллобластомы, наиболее распространенной злокачественной опухоли головного мозга у детей и ведущей причины детской смертности, к индукторам ферроптоза остается в значительной степени неизученной. Насколько нам известно, существует мало рецензируемой литературы, связывающей ферроптоз и медуллобластому. Тем не менее, некоторые исследования показали, что железо играет решающую роль в выживании, пролиферации и онкогенном потенциале стволовых клеток (ОСК) медуллобластомы и глиобластомы17,18, потенциально делая их более уязвимыми к индукции ферроптоза. Это особенно важно, поскольку медуллобластома печально известна своей субпопуляцией ОСК, или клеток, инициирующих/размножающихся опухолью, которые, по-видимому, в значительной степени ответственны за химиорезистентность, диссемицию и рецидив опухоли¹⁹.

Чувствительность к индукции ферроптоза обычно исследуется путем измерения содержания/накопления гидропероксида липидов, что может привести или не привести к гибели клеток. Наиболее часто используемыми индукторами ферроптоза являются (1) эрастин, ингибитор транспортера xCT²⁰, (2) RSL3, ингибитор фермента GPx4² и/или (3) доноры железа, такие как цитрат ферроаммония (FAC)²¹. Содержание гидропероксида липидов оценивают с помощью селективного зонда BODIPY 581/591 C11²², который в восстановленном состоянии имеет максимумы возбуждения и излучения на длине волны 581/591 нм. При взаимодействии с гидропероксидами липидов и их окислении зонд смещает максимумы возбуждения и излучения до 488/510 нм. Как правило, значительное увеличение содержания гидропероксида липидов предшествует гибели ферроптозных клеток. Поскольку ферроптоз не является запрограммированной клеточной смертью, не существует молекулярного сигнального каскада, ведущего к его осуществлению. Поэтому единственным способом подтвердить это является контроль содержания гидропероксида липидов и использование специфических ингибиторов для этого типа клеточной гибели, таких как ферростатин 1²³. Ферростатин 1 является липофильным антиоксидантом, который может проникать в липидный компартмент клетки и выводить токсины гидропероксидов липидов, тем самым предотвращая ферроптозные события.

Protocol

Настоящее исследование проводилось с использованием клеточных линий медуллобластомы дикого типа (WT) DAOY, которые культивировали при 37 °C с 5%CO2 в среде DMEM с добавлением 8% FBS. Удаленную xCT клеточную линию поддерживали в тех же условиях, проводя эксперименты в средах с добавлением 1 мМ N-…

Representative Results

Клеточную линию медуллобластомы DAOY культивировали в стандартной среде DMEM с добавлением 8% FBS до достижения примерно 60% конфлюенции. В день эксперимента были собраны клетки, и 1 000 000 клеток на лунку были помещены в 6-луночные планшеты, согласно таблице 1. На следующий день клетки (в …

Discussion

Основным признаком гибели ферроптозных клеток является неконтролируемое накопление гидропероксидов липидов в плазматической мембране. Это окислительное повреждение может происходить ферментативным или неферментативным способом, но в любом случае реакция является железозависимой…

Materials

BODIPY 581/591 C11	Thermo Fisher	D3861
Cell counter	Beckman	Coulter Z1
DMEM medium	Gibco	10569010
Erastin	Sigma-Aldrich	E7781-5MG
Ferroamminium citrate	Acros Organics	211842500
Ferrostatin-1	Sigma-Aldrich	SML0583-25MG
Fetal bovin serum (FBS)	Dominique Dutcher	500105N1N
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACS Melody
Gibco StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Thermo Fisher	11599686
N-acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A7250
PlasmoTest Mycoplasma Detection Kit	InvivoGen	rep-pt1
propidium iodide	Invitrogen	P3566
RSL3	Sigma-Aldrich	SML2234-25MG
Trypsin – EDTA 10X – 100 mL	Dominique Dutcher	X0930-100