マトリゲル上のMEFから分割ヒトES細胞：MEFのからマトリゲル2〜
Summary
このビデオでは、フィーダー細胞を含まない条件とどのように継続的にフィーダー細胞を含まない条件で継代ヒトESにおけるヒト胚性幹細胞（ヒトES）の成長を維持する方法を示します。免疫蛍光顕微鏡法でフィーダー細胞を含まない条件で増殖させた多能性hESCの確認にも示されている。 3パート2。
Abstract
このビデオでは、どのようにMEFプレートからのフィーダー細胞を含まないマトリゲルプレートへ継代ヒトESへのマウス胚性線維芽細胞（MEF）をフィーダー細胞上のヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）、成長する方法を示します。
Protocol
ヒトES細胞の培養日常のメンテナンスヒトES細胞の培養培地は、すべて24時間を変更する必要があります。 4℃で保存したESメディアストックボトルから、（6ウェルプレートあたり〜20ml）を必要な液量を、50ミリリットルファルコンチューブの場所、そして℃の水浴中で37に暖かいを取り出します。メディアが暖めされると、10ng/mlの最終濃度に4℃で保存されているbFGFを° Cを追加。 4で?…
Discussion
このビデオでは、どのように通過ヒトESへMEFプレートからのフィーダー細胞を含まないマトリゲルプレートに示しています。マトリゲル上でコロニーの密度がMEFの上に通常の分割により、コロニーの密度より高いことに注意してください。このようなOCT – 4およびSSEA – 4、などのhESCの多能性マーカー、のための免疫蛍光染色し、顕微鏡またはフローサイトメトリーは、フィーダーを含まない培養条件で未分化?…
Acknowledgements
Teitellラボでヒト胚性幹細胞研究は再生医療のためのカリフォルニア工科大学（CIRM）種子助成RS1 – 00313でサポートされています。我々は、UCLA、特に博士Amanderクラーク博士ジェロームザック、そして我々の研究の支援のためのUCLAのブロード研究所の幹細胞の中核施設のメンバーで、再生医療と幹細胞研究のブロードセンターのメンバーに感謝。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | Gibco | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | Gibco | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | Gibco | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | Gibco | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | Gibco | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | Gibco | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | Gibco | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phycoerythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch Laboratories. Inc. | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. a. m. e. s. A., Itskovitz-Eldor, J. o. s. e. p. h., Shapiro, S. a. n. d. e. r. S., Waknitz, M. i. c. h. e. l. l. e. A., Swiergiel, J. e. n. n. i. f. e. r. J., Marshall, V. i. v. i. e. n. n. e. S., Jones, J. e. f. f. r. e. y. M. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. h. u. n. h. u. i., Inokuma, M. a. r. g. a. r. e. t. S., Denham, J. e. r. r. o. d., Golds, K. a. t. h. a. l. e. e. n., Kundu, P. r. a. t. i. m. a., Gold, J. o. s. e. p. h. D., Carpenter, M. e. l. i. s. s. a. K. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
Cite This Article
Khvorostov, I., Zhang, J., Teitell, M. From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel. J. Vis. Exp. (16), e831, doi:10.3791/831 (2008).