从MEFs基质胶2：到基质胶从MEFs分裂的胚胎干细胞
Summary
本视频演示了如何维持人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）在馈线无细胞的条件和如何在馈线不断通过人类胚胎干细胞的无细胞条件的增长。在馈线无细胞的条件下，免疫荧光显微镜确认的人类胚胎干细胞的全能性增长也表明。
Abstract
本视频演示了如何生长在人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层细胞，如何通过MEF的板人类胚胎干细胞馈线无细胞基质胶板。
Protocol
人类胚胎干细胞文化的日常维护人类胚胎干细胞的培养基必须24小时更换一次。从ES传媒股票在4 ° C储存瓶，拿出解决方案所需（〜20毫升每6孔板），在一个50毫升猎鹰管地方，和温暖的37℃水浴中。一旦媒体被加热，添加碱性成纤维细胞生长因子保存在4 ° C的终浓度在10ng/ml。在4 ° C，使用后立即把碱性成纤维细胞生长因子股票！ 从6孔板删除，但〜媒体500μL。确保摇动培养皿暂停去?…
Discussion
本视频演示了如何通过胚胎干细胞MEF板料器无细胞基质胶板。请注意，对基质胶的殖民地密度高于MEFs通常分裂菌落密度。人类胚胎干细胞全能性的标志物，如Oct – 4和SSEA – 4，免疫荧光染色和显微镜或流式细胞仪需要在馈线的文化条件，以确认人类胚胎干细胞保持在未分化状态。
Acknowledgements
在Teitell实验室的人类胚胎干细胞研究是由加州再生医学研究所（CIRM）种子批RS1 – 00313的支持。我们感谢的再生医学和干细胞研究的加州大学洛杉矶分校，特别是博士Amander克拉克，博士杰罗姆扎克，和加州大学洛杉矶分校的Broad研究所干细胞核心设施为支持我们的研究成员的广泛中心的成员。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | Gibco | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | Gibco | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | Gibco | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | Gibco | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | Gibco | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | Gibco | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | Gibco | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phycoerythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch Laboratories. Inc. | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. a. m. e. s. A., Itskovitz-Eldor, J. o. s. e. p. h., Shapiro, S. a. n. d. e. r. S., Waknitz, M. i. c. h. e. l. l. e. A., Swiergiel, J. e. n. n. i. f. e. r. J., Marshall, V. i. v. i. e. n. n. e. S., Jones, J. e. f. f. r. e. y. M. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. h. u. n. h. u. i., Inokuma, M. a. r. g. a. r. e. t. S., Denham, J. e. r. r. o. d., Golds, K. a. t. h. a. l. e. e. n., Kundu, P. r. a. t. i. m. a., Gold, J. o. s. e. p. h. D., Carpenter, M. e. l. i. s. s. a. K. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
Cite This Article
Khvorostov, I., Zhang, J., Teitell, M. From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel. J. Vis. Exp. (16), e831, doi:10.3791/831 (2008).