Çiftleşme ve Yumurta Evrelemesi: Embriyo Üretme ve Gelişim Aşamasına Göre Sıralama Yöntemi

- Bir çiftleşme tankı, yumurtaların düşmesini sağlayan çıkarılabilir kesici uçlu bir tankla başlayın. Embriyo toplamadan önce akşam iki erkek ve üç dişi yetişkin balığı bir gecede birbirine alışmak için bölünmüş bir çiftleşme tankına ekleyin.

Ertesi sabah, balığı sistem suyu içeren yeni bir çiftleşme tankına aktarın ve bölücüyü çıkarın. Balıklara çiftleşmek ve yumurtlamak için zaman vermek için 15 ila 30 dakika bekleyin.

Şimdi embriyoları toplayın ve Hank'in embriyo ortamını içeren bir Petri kabında saklayın. Protokol boyunca 28,5 santigrat derecede yetiştirin. Embriyoların morfolojisini bir diseksiyon mikroskobu altında inceleyin.

Birkaç gelişimsel özellik gözlemleyeceksiniz. Blastodisc'in bölünmesi birden fazla hücreye yol açar. Blastoderm yumurta sarısı hücresinin üzerinde ters bir kap şeklini alır. Paraksiyal mezoderm segmentleri embriyonun dorsal kısmında gelişir ve benzeri.

Döllenme sonrası 24 saatin ötesinde, embriyoları toplam vücut uzunluğuna göre sıralayın. Örnek protokolde, transgenik mCherry muhabir balıklarının çiftleşmesini ayarlayacağız ve elde edilen embriyoları sıralayacağız.

- Başlamak için, üreme olgunluğu olan üç aylık kültür embriyoları. embriyo toplanmasından önceki akşam iki yetişkin erkek ve üç dişi balığı istenen suşun bölünmüş çiftleşme tanklarına ayırın. Işıklar yandıktan sonraki sabah, bölücüyü çıkarın ve tankın dibinde embriyolar gözlemlenene kadar balıkların doğal olarak çiftleşmesini izin verin.

Embriyoları 30 dakikalık aralıklarla toplayın ve istenen sayı toplanana kadar embriyo ortamının Petri kaplarını ayırın. Embriyoları sahnelemek için, tüm embriyoların tutarlı gelişimsel zamanlamasını teşvik etmek için 10 santimetrelik Petri kabı başına 50 ila 75 kişilik gruplar halinde kültür edin.

Döllenme veya HPF sonrası yaklaşık 24 saate kadar segmentasyondan sonra somite sayısını kullanarak embriyo yaşını ölçün ve embriyoları gelişim yaşına göre ayırın.