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Suivi de l'activité ubiquitine-protéasome dans les cellules vivantes aide d'un Degron (dgn)-déstabilisé Green Fluorescent Protein Reporter Protéines (GFP) à base de
JoVE 신문
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JoVE 신문 생물학
Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein
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Suivi de l'activité ubiquitine-protéasome dans les cellules vivantes aide d'un Degron (dgn)-déstabilisé Green Fluorescent Protein Reporter Protéines (GFP) à base de

DOI:
10.3791/3327-v

•

10:25 min

•

November 10, 2012

•

, , , ,
1Molecular and Cell Biology,Institute for Biomedical Aging Research, 2Department of Gerontology and Geriatrics, Netherlands Consortium for Healthy Aging,Leiden University Medical Center

Chapters

  • 00:00Title
  • 01:21Virus Production
  • 04:11Titering of Virus
  • 06:13Transduction of Human Diploid Fibroblasts
  • 07:19FACS Experiments
  • 08:50Proteasomal Activity in vivo
  • 10:04Conclusion

Summary

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Procédé pour surveiller l'activité ubiquitine-protéasome dans les cellules vivantes est décrit. Un degron-GFP déstabilisée-(GFP-dgn) et une protéine de fusion GFP-stable dgnFS sont générés et transduites dans la cellule en utilisant un vecteur d'expression lentiviral. Cette technique permet de générer une lignée stable de cellules exprimant GFP-dgn/GFP-dgnFS dans lequel l'activité ubiquitine-protéasome peut être facilement évaluée en utilisant épifluorescence ou la cytométrie en flux.

Tags

Ubiquitin-proteasome ActivityDegronGreen Fluorescent Protein (GFP)Reporter ProteinProteolysisIntracellular OrganelleAbnormal ProteinsMisfolded ProteinsDamaged ProteinsOxidized ProteinsProteasome MaintenanceCellular ProcessesStress ResponseCell Cycle RegulationCellular DifferentiationImmune System ResponseUbiquitin-proteasome System DysfunctionTumorsNeurodegenerative DiseasesCellular SenescenceOrganismal AgingPrimary CellsLentiviral Expression VectorsTransfection Efficiency

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