Summary
Эта процедура описывает обнаружение и изоляцию мыши лейкоцитов TH17, которая активно секретируют ИЛ-17 при стимуляции.
Abstract
Секреция цитокинов MACS Пробирной технология позволяет обнаруживать секретируемых цитокинов на одном уровне клеток и чувствительных изоляции жизнеспособных цитокин-секретирующие клетки. Для того, чтобы этикетка Ил-17-секретирующих клеток, суспензии отдельных клеток мыши спленоцитов готовится и стимулировали при 37 ° С с PMA / иономицина вызывать секрецию цитокинов. Чтобы остановить секреции клетки затем помещали на лед и подвергаются Ил-17 Поймайте реагента би-специфические антитела, которые связываются с CD45 на поверхности клеток лейкоцитов и на Ил-17, как это выделяется и поймал возле клеточной поверхности. Секреция затем снова начал, повышая температуру до 37 ° С и Ил-17 захватывается Поймать реагентов. Секреция затем снова остановился, поставив клетки на льду. Чтобы обнаружить ловушку Ил-17, клетки инкубировали с второй Ил-17-специфических антител конъюгированных с биотином и Anti-биотин-PE антитела. Клетки могут теперь быть непосредственно анализировали с помощью проточной цитометрии или подготовленные для изоляции и обогащение последующей маркировки с анти-PE сопряженных микрошарики.
Protocol
Подготовка реагентов
- Сделать буфер, содержащий PBS с BSA (0,5%), и 2 мМ ЭДТА. Потому что пузырьки воздуха могут блокировать колонны MACS разделения, буфер должен быть дегазированной и хранить при температуре 2-8 ° С до использования.
- Мы используем RPMI 1640, содержащей 5% сыворотки мыши. Культуральная среда не должна содержать BSA или ФТС, так как эти соединения будут менять специфику стимуляции клеток.
- Ил-17 Мышь Секреция Пробирной - обогащение клеточной и обнаружения Kit от Miltenyi-Biotec. Набор содержит следующие компоненты: Ил-17 Поймайте реагентов, Ил-17 обнаружение антител (биотин), Anti-биотин-PE, а также Anti-PE микрошарики.
Стимулирование Спленоциты
- Этот протокол выполняется в присутствии отрицательных и положительных контроля, таких как нестимулированных спленоцитов и контрастирующая для Т-клеток. Этот протокол осуществляется с использованием стерильной техники.
- Подготовка суспензии отдельных клеток мыши спленоцитов, которые были изолированы с помощью диссоциатор gentleMACS ™. Концентрации клеток должны быть заранее определены с помощью подсчета клеток. Гранул клеток при 200 × г в течение 10 минут при комнатной температуре.
- После центрифугирования супернатант аспирата от гранул с помощью пипетки. Не переливать трубку, чтобы избежать потери гранул.
- Теперь, ресуспендирования клеток в культуральной среде, а затем добавить в колодец. Добавьте достаточное средство для концентрации в десять миллионов клеток на мл и пять миллионов клеток на квадратный сантиметр.
- Чтобы стимулировать иммунный ответ в нашем ресуспендировали клетки, мы добавляем иономицина (1 мкг / мл) и PMA (10 нг / мл), образец и перемешать раствор, осторожно пипетирования вверх и вниз. Затем скважин маркированы соответственно.
- Теперь мы инкубировать наших клетках в течение 3 часов при 37 ° С без перемешивания, чтобы начать стимуляцию периода. Приступить к Ил-17 Анализ 3-х часов от начала стимуляции, так что планируйте соответственно.
- Чтобы остановить секрецию, клетки помещали на лед, и мы собираем стимулированных клеток, мягко пипетирования вверх и вниз с холодной буфера. Затем клетки передается от скважины до трубки и моются во второй раз.
- Чтобы убедиться, что все клетки собираются, это хорошая идея, чтобы проверить ваше блюдо под микроскопом. Если клетки по-прежнему остаются прикрепленными, можно собрать оставшиеся клетки путем промывки блюдо с холодной буфера. Любая клетка сгустки в вашей клеточной суспензии можно удалить с помощью предварительного отделения фильтров.
Маркировка Клетки с Поймать реагент
- Крайне важно отметить, что в этом анализе работ оптимально, если менее 2% от Ил-17-секретирующих клеток.
- Если концентрация ИЛ-17 клетки, секретирующие как ожидается, будет выше 2% корректировать объемы соответственно.
- Одним из потенциальных ловушка этой процедуры является перекрестное загрязнение Поймать реагентов, которые могут возникнуть в процессе маркировки, когда би-специфическое антитело связывается с не-секретирующие Т-клеток и ловушки Ил-17 выделяется из соседних лимфоцитов, тем самым генерации ложных срабатываний.
- Для того чтобы обойти эту проблему, очень важно, чтобы охладить ячейки вниз до маркировки и работа с холодным буфером, чтобы замедлить распространение Ил-17 и избежать перекрестного загрязнения. В дополнение к поддержанию клетки холодно, они должны храниться при определенной концентрации.
- Чтобы начать процедуру маркировки, мы используем десять миллионов клеток в 15 мл закрывающуюся пробирку. Если высшие номера сотовых должны быть использованы, просто масштаб копии всех томов соответственно. После оптимальной концентрации клетка была получена, мыть клетки, добавляя 10 мл холодного буфера.
- Спином вниз клетки при 300 × г в течение 10 минут в охлажденном центрифуги (2-8 ° С).
- После центрифугирования супернатант аспирата полностью с помощью пипетки. Не переливать супернатант так как это приведет к потере клетки и неточные томов. Повторите промывание шаг, который заключается в добавлении 10 мл холодного буфера, центрифугирование, и стремление.
- Теперь, когда мы гранул желаемой чистоты, ресуспендирования клеток в 80 мкл холодной питательной среды. Чтобы пометить их, мы добавим 20 мкл Мышь Ил-17 Поймайте реагентов.
- Инкубируйте клетки в течение 5 минут на льду.
- После 5 минут инкубационного периода на льду, снимите трубку и разбавленных клеток в 10 мл 37 ° С теплой среде. Затем зафиксируйте трубы на трубы Rotator MACSmix и инкубировать трубке при 37 ° С в течение 45 мин при непрерывном движении. Повышение температуры до 37 ° С, будет возобновление секреции цитокинов.
Маркировка Клетки с Ил-17 обнаружение антител (биотин) и Анти-биотин-PE
- После 45-минутного периода секреции при 37 ° С, положите трубку сразу же на льду. Это остановит секреции цитокинов. С этого момента очень важно сохранить клетки на льду.Работа с холодным буфер позволит избежать перекрестного загрязнения Поймать реагентов.
- Заполнение трубы с холодной буфера и центрифуге при 300xg при температуре 2-8 ° С в течение 10 мин. Аспирируйте супернатант полностью. Повторите мыть шаг еще раз.
- Осадок клеток ресуспендируют в 80 мкл холодного буфера и трубки помещают на лед.
- Во избежание неспецифического связывания антител, мы рекомендуем добавлением 10 мкл FcR Blocking Reagent и инкубировать на льду в течение 5 мин. Затем мы добавляем 20 мкл Мышь Ил-17 обнаружение антител (биотин), что сопряжено с биотином и инкубировать в течение 10 минут на льду.
- Еще раз, мыть клетки, как мы делали раньше, добавляя 10 мл холодного буфера и центрифуге при 300xg при температуре 2-8 ° С в течение 10 мин.
- Теперь аспирата супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 80 мкл холодного буфера.
- Добавьте 20 мкл наши вторичные антитела, анти-биотин-PE.
- Смешайте клетки и вторичные антитела решение, и снова инкубируют трубку в течение 10 минут на льду.
- После этого второй инкубации завершения мытья клеток с 10 мл холодного буфера и центрифуги.
- Гранулы теперь можно ресуспендировали в 500 мкл холодного буфера.
- Если клетки должны быть отделены для дальнейшего анализа вниз по течению, они могут быть магнитно помечены Anti-PE-микрошарики и отделена вручную или с использованием автоматизированных MACS MACS Колонны и сепараторы.
- Мы уже завершили маркировки спленоцитов и готовы для анализа.
FACS анализ
- Для нашего анализа мы будем сравнивать стимулируется и нестимулированных спленоцитов с помощью проточной цитометрии.
- Перед проточной цитометрии, клетки окрашивали пропидий йодида на уровне 0,5 мкг / мл до ворот из мертвых клеток. MACSQuant Analyzer ™ была загружена 200000 клеток для каждого образца, и теперь мы будем смотреть на графиков разброса относительной реакционной антител в образцах. Два важных соображения для анализа редких клеток - типа Ил-17-положительных клеток - с помощью проточной цитометрии являются:
- установка ворот на лимфоцитов вперед по сравнению с разбросом сюжет стороны разброса
- стробирования и из мертвых клеток (окрашенных йодистым пропидий) и В-клеток (которые могут вызвать неспецифические окрашивания фона) для дальнейшего повышения чувствительности обнаружения
- Мы использовали CD4-APC антител для обнаружения Т-клеток и антител CD45R/B220-PerCP для выявления В-клеток. Мы видим, вперед и стороной разброс свойств образцов и применить ворота на популяции лимфоцитов.
- Вторые ворота была применена, чтобы увидеть витражи мертвых клеток и окрашенных клеток B (Y ось). Эти клетки, исключаются из анализа Т клетки.
- В этом примере, который по сути наш отрицательный контроль, мы видим, что Есть очень мало Ил-17 CD4 секретирующих положительные Т-клетки в нестимулированных образцов - около 0,003% (рис. 4). Глядя на стимулировали население Т-клеток, мы можем видеть значительное число CD4 + Т-клеток, которые секретируют ИЛ-17 - около 0,367% (рис. 5А) до разделения и 60,76% после магнитной сепарации с MACS Technology (рис. 5б).
Discussion
TH17 клетки играют важную роль в адаптивного иммунитета и воспалительного ответа и являются ключевым компонентом в продвижении аутоиммунного воспаления.
Это видео документов, как использовать мышь Miltenyi на Ил-17 Секреция Пробирной - обогащение клеточной и Detection Kit (PE). При выполнении этой процедуры очень важно, чтобы оценка частоты Ил-17-секретирующих клеток в начальной ячейки подготовки. Соответствующей концентрации клеток при маркировке и периода секреции цитокинов предотвращает перекрестное заражение других клеток в вашей подвески и обеспечивает надежные результаты.
Disclosures
Все протоколы и спецификации доступны на www.miltenyibiotec.com.
Предупреждения
Реагенты содержат азид натрия. В кислой среде азид натрия образует азотистоводородную кислоту, которая является чрезвычайно токсичным. Азид соединений должен быть разведен с проточной водой, прежде чем выбросить. Эти меры предосторожности для избежания депозитов в водопровод, где взрывной условиях может развиться.
Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
Mouse IL-17 Secretion Assay Cell Enrichment and Detection Kit (PE) | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-094-213 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx |
RPMI 1640 | Medium | Miltenyi Biotec | 130-091-440 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx |
CD4-APC | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-091-611 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx |
CD8a-FITC | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-091-605 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx |
Propidium Iodide Solution | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx |
FcR Blocking reagent, mouse | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx |
Dead Cell Removal Kit | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
MACSmix Tube Rotator | Instrument | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx |
gentleMACS™ Dissociator | Instrument | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx |
autoMACS Pro Starting Kit | Instrument | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx |
MACS Columns | Tool | Miltenyi Biotec | http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx | |
MACS Separator | Tool | Miltenyi Biotec |