יצירת עוברים דג הזברה chimeric על ידי השתלה
Summary
מדריך צעד אחר צעד כדי ליצור ממוקד עוברי דג הזברה chimeric על ידי השתלת בשלב blastula או gastrula.
Abstract
אחד הכלים החזקים ביותר בשימוש כדי לקבל תובנה תהליכים התפתחותיים מורכבים היא ניתוח של עוברים chimeric. הכימרה מוגדר אורגניזם המכיל תאים מבעל חיים אחד או יותר; פסיפסים הם סוג אחד של הכימרה, שבו תאים גנוטיפ יותר מעורבים, בדרך כלל wild-type ו מוטציה. בשנת דג הזברה, מפלצות יכול להתבצע בקלות על ידי השתלה של תאים מעובר לעובר התורם מארח בשלב העוברי המתאים. תאים התורם תווית מופקים על ידי הזרקת סמן השושלת, כגון פלורסנט לצבוע, לעובר אחד תא הבמה. תאים התורם תווית יוסרו מעוברים התורם הוכנס עוברים לארח ללא תווית באמצעות נפט שבשליטת פיפטה זכוכית רכוב על תרכובת מיקרוסקופ או לנתח. תאים התורם יכול במקרים מסוימים להיות ממוקד לאזור ספציפי או רקמות של העובר המתפתח blastula או gastrula מארח שלב על ידי בחירת האתר השתלת העובר מארח מבוסס על ומבוססת מפות גורל.
Protocol
Discussion
הקלות שבה השתלה ניתן להשתמש כדי לייצר מפלצות ממוקד היא אחת המעצמות הגדולות של דג הזברה כמודל החולייתנים. שינוי של פרוטוקול זה לא שתואר לעיל מאפשר ניתוח של תפקוד הגן האימהי עבור הגנים עם תפקידים חיוניים להתפתחות zygotic. מאחר דגים מוטנטים לא יכולים לשרוד עד לבגרות, יש צור…
Acknowledgements
תודה לחברי במעבדה Moens עבור קלט מועיל במהלך כתיבת מאמר זה. HK הוא פוסט דוקטורט נתמך על ידי NIH / NICHD מענק # 5R01HD037909-08. CBM הוא חוקר עם הווארד יוז רפואי במכון.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Injection rig | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | Foot pedal can be ordered separately | |
| Pronase | Sigma | P5147 | “protease type XIV” | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458 | 100x stock | |
| Methyl cellulose | Sigma | M-0387 | ||
| Fluorescent dextrans | Molecular Probes/ Invitrogen | various | Eg. lysine-fixable rhodamine dextran (D7162) | |
| Injection pipettes (1.2mmx0.94mmx10cm) | Sutter | BF120-94-10 | ||
| Transplant pipette option 1 | World Precision Instruments | TW100-4 | ||
| Transplant pipette option 2 | VWR | #53508-400 | ||
| micromanipulator | Narishige | UMJ-3FC (?) | ||
| Micromanipulator magnetic stand | Narishige | GJ-1 | ||
| Transplant apparatus | Sutter Instrument Co. | MI-10010 | ||
| Fine micromanipulator | Narishige | MMO-203 | ||
| Depression slides | Fisher | 12560A | ||
| Agar molds for injection and transplants | AL-AN Mfg, Inc. |
Reagents: Recipes for many of the reagents used for these procedures are found in The Zebrafish Book, which is available in full online at http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Recipes are provided there for preparation of Fish Water, Embryo Medium with and without antibiotics, pronase for dechorionating, fluorescent dextrans, and methyl cellulose.
Referências
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. , (2000).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Cell lineage and developmental potential of cells in the zebrafish embryo. Trends Genet. 4, 68-74 (1988).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. Origin and organization of the zebrafish fate map. Development. 108, 581-594 (1990).
- Woo, K., Fraser, S. E. Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system. Development. 121, 2595-2609 (1995).
- Raz, E. Primordial germ-cell development: the zebrafish perspective. Nat Rev Genet. 4, 690-700 (2003).
- Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124, 3157-3165 (1997).
- Koprunner, M., Thisse, C., Thisse, B., Raz, E. A zebrafish nanos-related gene is essential for the development of primordial germ cells. Genes Dev. 15 (21), 2877-2885 (2001).
- Weidinger, G., Wolke, U., Koprunner, M., Klinger, M., Raz, E. Identification of tissues and patterning events required for distinct steps in early migration of zebrafish primordial germ cells. Development. 126 (23), 5295-5307 (1999).
- Weidinger, G. Regulation of zebrafish primordial germ cell migration by attraction towards an intermediate target. Development. 129 (1), 25-36 (2002).
- Ciruna, B. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14919-14924 (2002).
- Waskiewicz, A. J., Rikhof, H. A., Moens, C. B. Eliminating zebrafish pbx proteins reveals a hindbrain ground state. Dev Cell. 3, 723-733 (2002).
- Weidinger, G. dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival. Curr Biol. 13, 1429-1434 (2003).
- Blaser, H. Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish. J Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).
