Создание химерных эмбрионов данио рерио по трансплантации
Summary
Шаг за шагом ведет к генерации целевого химерных эмбрионов данио путем трансплантации в бластулы или гаструлы.
Abstract
Один из самых мощных инструментов, используемых, чтобы разобраться в сложных процессах развития является анализ химерных эмбрионов. Химера определяется как организм, который содержит клетки, из более чем одного животного; мозаики являются одним из типов химер, в которых клетки из более чем одного генотипа смешиваются, обычно дикого типа и мутанта. В данио, химеры могут быть легко сделаны трансплантации клеток от донора эмбриона в хост эмбриона на соответствующие зачаточном состоянии. Меченых клеток донора генерируются путем инъекции линии маркера, такие, как флуоресцентный краситель, в один-клеточной стадии эмбриона. Меченые клетки донора будут удалены из доноров эмбрионов и внедрена в немеченого эмбрионов хоста с помощью масла контролируемого пипетки стекла установлен на любой соединения или рассекает микроскопом. Донорские клетки в некоторых случаях может быть направлена на конкретного региона или ткани развивающихся бластулы или гаструлы зародыш хост этапе, выбрав трансплантации сайта в принимающей эмбрион на основе четко установленных карт судьбы.
Protocol
Discussion
Легкость, с которой трансплантации может быть использована для выпуска целевых химеры является одной из великих держав данио, как позвоночных модели. Модификации этого протокола, не описанные выше, позволяет анализ материнской функции гена генов с существенную роль в зиготических ра?…
Acknowledgements
Благодаря членам лаборатории Moens для полезной информации во время написания этой статьи. HK является после защиты докторской диссертации поддерживается NIH / NICHD грант № 5R01HD037909-08. CBM является следователь Медицинского института Говарда Хьюза.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Injection rig | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | Foot pedal can be ordered separately | |
| Pronase | Sigma | P5147 | “protease type XIV” | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458 | 100x stock | |
| Methyl cellulose | Sigma | M-0387 | ||
| Fluorescent dextrans | Molecular Probes/ Invitrogen | various | Eg. lysine-fixable rhodamine dextran (D7162) | |
| Injection pipettes (1.2mmx0.94mmx10cm) | Sutter | BF120-94-10 | ||
| Transplant pipette option 1 | World Precision Instruments | TW100-4 | ||
| Transplant pipette option 2 | VWR | #53508-400 | ||
| micromanipulator | Narishige | UMJ-3FC (?) | ||
| Micromanipulator magnetic stand | Narishige | GJ-1 | ||
| Transplant apparatus | Sutter Instrument Co. | MI-10010 | ||
| Fine micromanipulator | Narishige | MMO-203 | ||
| Depression slides | Fisher | 12560A | ||
| Agar molds for injection and transplants | AL-AN Mfg, Inc. |
Reagents: Recipes for many of the reagents used for these procedures are found in The Zebrafish Book, which is available in full online at http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Recipes are provided there for preparation of Fish Water, Embryo Medium with and without antibiotics, pronase for dechorionating, fluorescent dextrans, and methyl cellulose.
Referências
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. , (2000).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Cell lineage and developmental potential of cells in the zebrafish embryo. Trends Genet. 4, 68-74 (1988).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. Origin and organization of the zebrafish fate map. Development. 108, 581-594 (1990).
- Woo, K., Fraser, S. E. Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system. Development. 121, 2595-2609 (1995).
- Raz, E. Primordial germ-cell development: the zebrafish perspective. Nat Rev Genet. 4, 690-700 (2003).
- Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124, 3157-3165 (1997).
- Koprunner, M., Thisse, C., Thisse, B., Raz, E. A zebrafish nanos-related gene is essential for the development of primordial germ cells. Genes Dev. 15 (21), 2877-2885 (2001).
- Weidinger, G., Wolke, U., Koprunner, M., Klinger, M., Raz, E. Identification of tissues and patterning events required for distinct steps in early migration of zebrafish primordial germ cells. Development. 126 (23), 5295-5307 (1999).
- Weidinger, G. Regulation of zebrafish primordial germ cell migration by attraction towards an intermediate target. Development. 129 (1), 25-36 (2002).
- Ciruna, B. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14919-14924 (2002).
- Waskiewicz, A. J., Rikhof, H. A., Moens, C. B. Eliminating zebrafish pbx proteins reveals a hindbrain ground state. Dev Cell. 3, 723-733 (2002).
- Weidinger, G. dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival. Curr Biol. 13, 1429-1434 (2003).
- Blaser, H. Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish. J Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).
