ELIME Método (Enzyme Linked Immuno Magnetic eletroquímica) para Detecção de micotoxinas

Summary

Um protocolo para detectar tricotecenos (micotoxinas de interesse para a saúde humana), utilizando um método de triagem recém-desenvolvido com base em um método imunoquímico competitiva e uma detecção eletroquímica final é demonstrada.

Abstract

Imunoensaios são uma alternativa válida para o mais caro e demorado quantitativa HPLC ou GC ^{1, 2} métodos para a detecção de triagem de micotoxinas perigosas em commodities de alimentos. Neste protocolo, mostramos como fabricar e interrogar uma enzima eletroquímica competitivas ligadas imunomagnética ensaio baseado no uso de esferas magnéticas como suporte sólido para a cadeia imunoquímicos ³ e eletrodos serigrafados como sensoriamento plataforma.

Nosso método visa determinar a quantidade total de HT-2 e T-2 toxinas, as micotoxinas, pertencente à família tricotecenos e de grande preocupação para a saúde humana ^4. A utilização de um clone de anticorpo com uma reatividade cruzada de 100% para HT-2 e T-2 permite detectar simultaneamente tanto toxinas com sensibilidade similar ^5.

O primeiro passo do nosso teste é a etapa de revestimento em que imobilizar HT2-KLH toxina conjugada na superfície das esferas magnéticas. Depois de uma etapa de bloqueio, necessário para evitar a não-específica absorções, a adição de um anticorpo monoclonal permite a competição entre imobilizada HT-2 e do presente livre HT-2 ou T-2 na amostra ou dissolvido em uma solução padrão.

No final da etapa de competição, a quantidade de anticorpo monoclonal ligado ao imobilizado HT-2 será inversamente proporcional à quantidade de toxina na solução da amostra.

Um anticorpo secundário marcado com fosfatase alcalina (AP) é usado para revelar a ligação entre o anticorpo específico ea imobilizada HT-2. A etapa de medição final é realizada por deixar cair uma alíquota de suspensão grânulo magnético, correspondente a uma determinada amostra de solução / standard, na superfície de um eletrodo serigrafado de trabalho; esferas magnéticas são imobilizados e concentrada por meio de um ímã colocado exatamente sob o serigrafado eletrodo. Após dois minutos de incubação entre as esferas magnéticas e um substrato para a AP, o produto enzimático é detectado por voltametria de pulso diferencial (DPV), utilizando um instrumento portátil (PalmSens) também capaz de iniciar automaticamente oito medidas dentro de um intervalo de poucos segundos.

Protocol

1) Bloqueio de esferas magnéticas revestidas: Proceder como a seguir para bloquear Revestido esferas magnéticas: Preparar um conjunto de 2 tubos Eppendorf ml; Homogeneizar (balançando, mas não vórtice) revestido esferas magnéticas (veja o apêndice para a preparação de esferas magnéticas revestidas) utilizando a amostra rotativa misturador; Imediatamente após a homogeneização, pipetar 10 ml de esferas magnéticas revestidas em cada tubos separados Eppe…

Discussion

O uso de anticorpos como sonda de reconhecimento biomolecular viu um uso generalizado de tecnologias de sensoriamento; metodologias de detecção imunoquímica, como os testes ELISA e Meias, são, hoje em dia, entre as plataformas mais utilizadas e aplicadas em muitos laboratórios ^7.

Embora essas abordagens alcançar a sensibilidade excepcional e especificidade, o objetivo principal dos muitos grupos de pesquisa nos últimos anos tem sido a melhoria e otimização de suas perform…

Materials

Reagents

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Potassium chloride	Sigma	P9333
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma	P9791
Disodium hydrogen phosphate	Sigma	S3264
Sodium chloride	Sigma	S3014
MgCl2 anhydrous	Sigma	M8266
DEA (99.5%)	Sigma	31589
HCl 37%	Sigma	320331
H3BO3	Sigma	B6768
Tris[hydroxymethyl]-aminomethane	Sigma	252859
BSA (albumin bovine serum)	Sigma	A4503
NaOH	Sigma	S5881
TWEEN 20	Sigma	P9416
NaN3	Aldrich	71290
1-Naphthyl phosphate disodium salt	Fluka	N7255
Skimmed milk blocking solution – non fat dry milk	Bio-Rad	170-6404
HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), stock solution (1 mg/ml in PBS):	Biopure	004050	The HT-2-KLH conjugate was obtained by CDI-method where the free OH-groups on position 3 and 4 at the HT-2 toxin were activated by N,N’-carbonyldiimidazole (CDI) and the activated HT-2 toxin was let to react with aminogroups of the protein (KLH) to generate a stable carbammate linkage.
Secondary labeled antibody: Anti-mouse IgG (H+L) from horse, conjugated with Alkaline Phosphatase, concentration 1 mg/ml.	Vector Laboratories	AP-2000
HT-2 toxin	Biopure
Magnetic beads: Dynabeads®	Dynal	M-280 Tosylactivated	Concentration 2 x 109 beads/ml.

Solutions

Name of the reagent	Preparation	Comments (optional)
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4	Dissolve 0.20 g of potassium chloride, 0.20 g of potassium dihydrogen phosphate, 1.16 g of disodium hydrogen phosphate and 8.00 g of sodium chloride in 900 ml of water
Diethanolamine buffer, DEA, 0.97 M + 1 mM MgCl2 + 0.15 M KCl, pH 9.8	Dissolve 0.0476g of MgCl2 anhydrous and 7.3.59 g of KCl in ~ 300 ml of water. After dissolution add 51 ml of DEA (99.5%). Adjust pH to 9.8 with HCl (6 M). Dilute to 500 ml with water.
Borate buffer, 0.1 M, pH 9.5	Dissolve 3.09 g of H3BO3 in ~ 300 ml of distilled water; adjust pH to 9.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 500 ml with distilled water.
TRIS buffer, 0.2 M, pH 8.5	Dissolve 3.85 g of Tris[hydroxymethyl]-aminomethane in 100 ml of water. Adjust to pH 8.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 200 ml with water.
TRIS buffer + BSA solution (0.1%), pH 8.4	Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of TRIS buffer pH 8.4.	This solution must be freshly prepared on the day of use.
PBS buffer + TWEEN® 0.05%	Dissolve 0.250 g of TWEEN 20 in 500 ml of the previously prepared PBS buffer, pH 7.4
PBS buffer + BSA solution 0.1%	Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3.	This solution must be freshly prepared on the day of use.
PBS buffer + BSA 0.1% + NaN3 0.02%	Dissolve 0.050 g of BSA and 0.010 of NaN3 in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3.	Storage solution
Enzymatic substrate	Dissolve 0.010 g of 1-Naphthyl phosphate sodium salt in 100 ml of DEA buffer pH 9.8. Wrap the flask tightly in aluminium foil.	This solution must be freshly prepared on the day of use.
Skimmed milk blocking solution	Add 0.20 g of Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) to 200 ml of PBS buffer pH 7.3.	This solution must be freshly prepared on the day of use.
HT-2 stock solution	Dissolve 10 mg of trichothecene HT-2 toxin vial, in 10 ml of acetonitrile to give a solution with a concentration of 1 mg/ml.	Split up this solution into single-use aliquots of 30 ml and store them at less than -30 °C.
HT-2 Working standard solution	Pipette 20 ml of HT-2 toxin stock solution into a 2 ml calibrated volumetric flask and dilute with acetonitrile to obtain a HT-2 working solution containing 10 μg /ml of trichothecene toxin.	This solution should be freshly prepared on the day of use.
HT-2 Working calibrant solutions	Dilute the HT-2 working standard solution (10 μg/ml) to prepare working calibrant solution 100 ng/ml. Dilute HT-2 working calibrant solution 100 ng/ml to prepare working calibrant solutions of the following concentrations 0 (blank), 0.5, 1, 2, 4, 10 ng/ml.	These solutions must be prepared fresh on the day of use.
HT-2 conjugated with KLH	Split up HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) stock solution (1 mg/ml in PBS) into single-use aliquots of 350 μl.	Store aliquots at -30 °C.
Specific Monoclonal Antibody	Dilute 1:350 (v:v) the stock concentration (1.383 mg/ml) of monoclonal antibody in PBS to use in competition step	This solution must be prepared fresh at the moment of use. 10 ml antibody stock solution in PBS for a final volume of 3.5 ml, are enough to analyze 17 standards and /or samples.
Secondary Labeled Antibody	Anti-mouse IgG (H+L) conjugated with Alkaline Phosphatase is diluted 1:100 (v:v) in PBS to use in competition step.	100 μl antibody stock solution in PBS for a final volume of 10 ml, are enough to analyze 25 standards and /or samples. This solution must be prepared fresh at the moment of use.

Apparatus

Name of the reagent	Company	Comments (optional)
Magnetic Particle Concentrator: MPC®-S	Dynal
PalmSens instrument	PalmSens	Provided with PalmSens Lite, Serial cable connecting PC laptop and Mux options software
CH8 PalmSens Multiplexer	PalmSens
Eight channel Mux electric contact	hand made
Strip with eight screen printed electrodes (SPEs)	hand made
Specially designed support for electrodes strip	hand made	Includes 8 neodymium magnets each of which is placed below each working electrode surface of the SPE
Calibrated microliter pipettes	Gilson
Magnetic stirrer and stir bars.
Glass beakers (100, 50, 20 ml).
Volumetric flasks (2ml).
0.2 and 2ml Eppendorf tubes.	Eppendorf
Falcon™ tubes of 5ml and 15ml.	Falcon
Laboratory Vortex Mixer		Do not use vortex mixer to resuspend magnetic beads coated with HT2-KLH or linked with immunological chain to avoid denaturing of proteic parts
Laboratory oven or thermostated room		Choose a oven able to keep a temperature of 37±3 °C.