Osservazione diretta del DNA Enzimi Replica utilizzando un singolo-molecola di DNA Stretching Assay

Summary

Descriviamo un metodo per osservare la replicazione in tempo reale di singole molecole di DNA mediate da proteine ​​del sistema di replica batteriofago.

Abstract

Descriviamo un metodo per osservare la replicazione in tempo reale di singole molecole di DNA mediate da proteine ​​del sistema di replica batteriofago. Linearizzato λ DNA è modificato in modo da avere un biotina alla fine di un filo, e un residuo di digossigenina sull'altra estremità del filo stesso. La fine biotinilato è collegato a un coprioggetto di vetro funzionalizzati e la fine digoxigeninated ad una piccola biglia. L'assemblaggio di questi DNA-tallone attacchi sulla superficie di una cellula di flusso consente un flusso laminare da applicare a esercitare una forza di resistenza sul tallone. Di conseguenza, il DNA è allungata vicina e parallela alla superficie del vetrino con una forza che è determinata dalla velocità di flusso (Figura 1). La lunghezza del DNA viene misurata attraverso il monitoraggio della posizione del tallone. Differenze di lunghezza tra il DNA a singolo e doppio filamento sono utilizzati per ottenere informazioni in tempo reale l'attività delle proteine ​​replica al bivio. Misurare la posizione del tallone consente precisa determinazione dei tassi e processivities del DNA di svolgimento e di polimerizzazione (Figura 2).

Protocol

1. DNA replica Template DNA per la reazione è un DNA λ linearizzato modificato dalla ricottura di oligonucleotidi per formare una forcella di replica. Inoltre, la biotina è fissata alla fine di un filamento del DNA λ, e un residuo di digossigenina è collegata all'altra estremità del filo stesso 1. Materiali: batteriofago λ DNA, Oligonucleotidi: braccio forcella biotinilato (A: 5'-biotina-AAAAAAAAAAAAAAAAGAGTACTGTACGATCTAGC…

Discussion

E 'importante assicurare che la forza di trascinamento esercitata dal flusso laminare perle non influenza le attività enzimatiche delle proteine ​​di replica. Per esempio, un 3 pN forza che corrisponde ad una portata di 0,012 ml / min non influenza la replicazione del filamento di DNA di primo piano. Si pregiudica tuttavia l'attività enzimatiche che avvengono durante la sintesi del DNA coordinato, e deve quindi essere ridotta a 1,5 pN. La forza di trascinamento può essere facilmente controllato modificand…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Bacteriophage λ DNA		New England Biolabs	N3011L
DNA Oligonucleotides		Integrated DNA Technologies
T4 DNA Ligase		New England Biolabs	M0202L
T4 Polynucleotide Kinase		New England Biolabs	M0201L
α-digoxigenin Fab		Roche	11214667001
Tosyl Activated Beads		Dynal/Invitrogen	142-03
Magnetic Separator		Invitrogen	Dynal MPC
3-aminopropyl-triethoxysilane		Sigma	A3648	Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces
Succinimidyl propionate PEG		Nektar		Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Biotin-PEG-NHS		Nektar		Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Double-sided tape		Grace BioLabs	SA-S-1L	100 μm thickness
Quartz slide		Technical Glass	20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H)	Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net)
Polyethylene tubing		Becton Dickinson	427416	0.76 mm ID, 1.22 OD Other size tubing can be substituted.
Streptavidin		Sigma	S4762	Make 1 mg/mL solution, 25 μL aliquots in PBS pH 7.3
Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix		New England Biolabs	N0447
Inverted Optical Microscope with 10X Objective		Olympus	Olympus IX-51
Permament rare-earth magnet		National Imports	www.rare-earth-magnets.com
CCD Camera		QImaging	Rolera-XR Fast 139
Syringe Pump		Harvard Apparatus	11 Plus	Operate in refill mode to facilitate solution changes
Fiber Illuminator		Thorlabs Inc.	OSL1