Descriviamo un metodo per osservare la replicazione in tempo reale di singole molecole di DNA mediate da proteine del sistema di replica batteriofago.
Descriviamo un metodo per osservare la replicazione in tempo reale di singole molecole di DNA mediate da proteine del sistema di replica batteriofago. Linearizzato λ DNA è modificato in modo da avere un biotina alla fine di un filo, e un residuo di digossigenina sull'altra estremità del filo stesso. La fine biotinilato è collegato a un coprioggetto di vetro funzionalizzati e la fine digoxigeninated ad una piccola biglia. L'assemblaggio di questi DNA-tallone attacchi sulla superficie di una cellula di flusso consente un flusso laminare da applicare a esercitare una forza di resistenza sul tallone. Di conseguenza, il DNA è allungata vicina e parallela alla superficie del vetrino con una forza che è determinata dalla velocità di flusso (Figura 1). La lunghezza del DNA viene misurata attraverso il monitoraggio della posizione del tallone. Differenze di lunghezza tra il DNA a singolo e doppio filamento sono utilizzati per ottenere informazioni in tempo reale l'attività delle proteine replica al bivio. Misurare la posizione del tallone consente precisa determinazione dei tassi e processivities del DNA di svolgimento e di polimerizzazione (Figura 2).
E 'importante assicurare che la forza di trascinamento esercitata dal flusso laminare perle non influenza le attività enzimatiche delle proteine di replica. Per esempio, un 3 pN forza che corrisponde ad una portata di 0,012 ml / min non influenza la replicazione del filamento di DNA di primo piano. Si pregiudica tuttavia l'attività enzimatiche che avvengono durante la sintesi del DNA coordinato, e deve quindi essere ridotta a 1,5 pN. La forza di trascinamento può essere facilmente controllato modificand…
Lo sviluppo del DNA che si estende test è stato aiutato da Paolo Blainey, Lee Jong-Bong, e Samir Hamdan. Questo lavoro è supportato dal National Institutes of Health per borse di Charles Richardson (GM54397), e Antoine van Oijen (GM077248).
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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Bacteriophage λ DNA | New England Biolabs | N3011L | ||
DNA Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | |||
T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | ||
T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | ||
α-digoxigenin Fab | Roche | 11214667001 | ||
Tosyl Activated Beads | Dynal/Invitrogen | 142-03 | ||
Magnetic Separator | Invitrogen | Dynal MPC | ||
3-aminopropyl-triethoxysilane | Sigma | A3648 | Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces | |
Succinimidyl propionate PEG | Nektar | Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc. | ||
Biotin-PEG-NHS | Nektar | Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc. | ||
Double-sided tape | Grace BioLabs | SA-S-1L | 100 μm thickness | |
Quartz slide | Technical Glass | 20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H) | Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net) | |
Polyethylene tubing | Becton Dickinson | 427416 | 0.76 mm ID, 1.22 OD Other size tubing can be substituted. |
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Streptavidin | Sigma | S4762 | Make 1 mg/mL solution, 25 μL aliquots in PBS pH 7.3 | |
Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix | New England Biolabs | N0447 | ||
Inverted Optical Microscope with 10X Objective | Olympus | Olympus IX-51 | ||
Permament rare-earth magnet | National Imports | www.rare-earth-magnets.com | ||
CCD Camera | QImaging | Rolera-XR Fast 139 | ||
Syringe Pump | Harvard Apparatus | 11 Plus | Operate in refill mode to facilitate solution changes | |
Fiber Illuminator | Thorlabs Inc. | OSL1 |