La observación directa de ADN Enzimas Replicar El uso de un ADN de una sola molécula de estiramiento de ensayo

Summary

Se describe un método para observar la replicación en tiempo real de las moléculas individuales de ADN mediada por proteínas del sistema de replicación del bacteriófago.

Abstract

Se describe un método para observar la replicación en tiempo real de las moléculas individuales de ADN mediada por proteínas del sistema de replicación del bacteriófago. Linealizado λ ADN se modifica para tener un biotina en el extremo de un hilo, y una fracción de digoxigenina en el otro extremo de la misma cadena. El final con biotina se une a un cubreobjetos funcionalizados y al final digoxigeninated a una pequeña cuenta. El montaje de estas correas de ADN derramará en la superficie de una célula de flujo permite un flujo laminar que se aplicarán para ejercer una fuerza de arrastre sobre el talón. Como resultado, el ADN se estira cerca y en paralelo a la superficie del cubreobjetos en una fuerza que está determinada por la velocidad de flujo (Figura 1). La longitud del ADN se mide mediante el control de la posición de la bola. Las diferencias de longitud entre el ADN de una sola y de doble cadena se utilizan para obtener información en tiempo real sobre la actividad de las proteínas de la replicación en el tenedor. Medición de la posición de la bola permite la determinación precisa de las tasas y processivities de anulación de ADN y la polimerización (Figura 2).

Protocol

1. Patrón de ADN de replicación ADN para la reacción es un ADN lineal λ modificado por hibridación de oligonucleótidos para formar un tenedor de replicación. Además, la biotina se adjunta al final de una cadena del ADN λ, y una fracción de digoxigenina se une al otro extremo de la misma línea 1. Materiales: bacteriófago λ ADN, oligonucleótidos: brazo tenedor biotinilado (A: 5'-biotina-AAAAAAAAAAAAAAAAGAGTACTGTACGATCTAGC…

Discussion

Es importante asegurarse de que la fuerza de arrastre ejercida sobre cuentas de flujo laminar no influye en la actividad enzimática de las proteínas de replicación. Por ejemplo, una fuerza de 3 PN que corresponde a un caudal de 0.012 ml / min no afectan a la replicación de la hebra de ADN líder. Sin embargo, sí afecta a las actividades enzimáticas que se producen durante la síntesis de ADN coordinado, y por lo tanto, tiene que reducirse a 1,5 pN. La fuerza de arrastre puede ser fácilmente controlado por el camb…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Bacteriophage λ DNA		New England Biolabs	N3011L
DNA Oligonucleotides		Integrated DNA Technologies
T4 DNA Ligase		New England Biolabs	M0202L
T4 Polynucleotide Kinase		New England Biolabs	M0201L
α-digoxigenin Fab		Roche	11214667001
Tosyl Activated Beads		Dynal/Invitrogen	142-03
Magnetic Separator		Invitrogen	Dynal MPC
3-aminopropyl-triethoxysilane		Sigma	A3648	Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces
Succinimidyl propionate PEG		Nektar		Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Biotin-PEG-NHS		Nektar		Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Double-sided tape		Grace BioLabs	SA-S-1L	100 μm thickness
Quartz slide		Technical Glass	20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H)	Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net)
Polyethylene tubing		Becton Dickinson	427416	0.76 mm ID, 1.22 OD Other size tubing can be substituted.
Streptavidin		Sigma	S4762	Make 1 mg/mL solution, 25 μL aliquots in PBS pH 7.3
Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix		New England Biolabs	N0447
Inverted Optical Microscope with 10X Objective		Olympus	Olympus IX-51
Permament rare-earth magnet		National Imports	www.rare-earth-magnets.com
CCD Camera		QImaging	Rolera-XR Fast 139
Syringe Pump		Harvard Apparatus	11 Plus	Operate in refill mode to facilitate solution changes
Fiber Illuminator		Thorlabs Inc.	OSL1