Прямое наблюдение Ферменты Репликация ДНК Использование одиночных молекул ДНК Растяжка Пробирной
Summary
Мы опишем метод для наблюдения реального времени репликации отдельных молекул ДНК посредничестве белков системы репликации бактериофагов.
Abstract
Мы опишем метод для наблюдения реального времени репликации отдельных молекул ДНК посредничестве белков системы репликации бактериофагов. Линеаризованные λ ДНК модифицируется, чтобы биотина на конце одной цепи, и дигоксигенин фрагмент на другом конце той же цепи. Биотинилированного конец крепится к функционализированных покровного стекла и digoxigeninated конец небольшой шарик. Сборка этих ДНК-бусинка тросов на поверхности проточной ячейке позволяет ламинарного течения, которые должны применяться приложить силы сопротивления на шарик. В результате ДНК растягивается вблизи и параллельно поверхности покровного на силу, которая определяется по скорости потока (рис. 1). Длина ДНК измеряется мониторинга положение валика. Длина различия между одно-и двухцепочечной ДНК используются для получения информации в реальном времени от активности белков репликации на вилку. Измерение положения шарик позволяет точно определить ставки и processivities ДНК размотки и полимеризации (рис. 2).
Protocol
Discussion
Важно, чтобы гарантировать, что сила сопротивления, действующая на бисер по ламинарного потока не влияет на ферментативную деятельность репликации белков. Например, 3 пН сила, которая соответствует скорости потока 0,012 мл / мин не влияет на репликацию ДНК, ведущей нити. Она тем не менее вл…
Acknowledgements
Развитие ДНК растяжение анализа была сообщница, Пол Blainey, Чен Ли Бон, и Самир Хамдан. Эта работа проводится при поддержке Национального института здоровья гранты Чарльз Ричардсон (GM54397), и Антуан ван Oijen (GM077248).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bacteriophage λ DNA | New England Biolabs | N3011L | ||
| DNA Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | |||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | ||
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | ||
| α-digoxigenin Fab | Roche | 11214667001 | ||
| Tosyl Activated Beads | Dynal/Invitrogen | 142-03 | ||
| Magnetic Separator | Invitrogen | Dynal MPC | ||
| 3-aminopropyl-triethoxysilane | Sigma | A3648 | Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces | |
| Succinimidyl propionate PEG | Nektar | Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc. | ||
| Biotin-PEG-NHS | Nektar | Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc. | ||
| Double-sided tape | Grace BioLabs | SA-S-1L | 100 μm thickness | |
| Quartz slide | Technical Glass | 20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H) | Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net) | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson | 427416 | 0.76 mm ID, 1.22 OD Other size tubing can be substituted. |
|
| Streptavidin | Sigma | S4762 | Make 1 mg/mL solution, 25 μL aliquots in PBS pH 7.3 | |
| Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix | New England Biolabs | N0447 | ||
| Inverted Optical Microscope with 10X Objective | Olympus | Olympus IX-51 | ||
| Permament rare-earth magnet | National Imports | www.rare-earth-magnets.com | ||
| CCD Camera | QImaging | Rolera-XR Fast 139 | ||
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 11 Plus | Operate in refill mode to facilitate solution changes | |
| Fiber Illuminator | Thorlabs Inc. | OSL1 |
Referências
- Lee, J. B. DNA primase acts as a molecular brake in DNA replication. Nature. 439, 621-624 (2006).
- Tanner, N. A., van Oijen, A. M. Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication. Methods Mol Biol. 521, 397-410 (2009).
- Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption. Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).
- Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. J Vis Exp. , (2009).
- Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis. Nature. 457, 336-339 (2009).
- van Oijen, A. M. Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder. Science. 301, 1235-1238 (2003).
