الملاحظة المباشرة من الحمض النووي الانزيمات تكرار استخدام الحمض النووي جزيء واحدة تمتد الفحص
Summary
نحن تصف طريقة لمراقبة حقيقية تكرار وقت جزيئات الحمض النووي الفردية بوساطة بروتينات للنظام عاثية تكرارها.
Abstract
نحن تصف طريقة لمراقبة حقيقية تكرار وقت جزيئات الحمض النووي الفردية بوساطة بروتينات للنظام عاثية تكرارها. تم تعديل خطي λ الحمض النووي لديهم البيوتين على نهاية واحدة حبلا ، وشاردة digoxigenin على الطرف الآخر من نفس حبلا. ويرد في نهاية biotinylated إلى ساترة الزجاج functionalized ونهاية digoxigeninated إلى حبة صغيرة. تجميع هذه الحبال حبة الحمض النووي على سطح خلية تدفق يسمح ليتم تطبيقها على تدفق الصفحي لممارسة القوة اسحب على حبة. نتيجة لذلك ، ويمتد على مقربة من الحمض النووي وموازية لسطح ساترة في القوة التي يحددها معدل التدفق (الشكل 1). ويتم قياس طول الحمض النووي عن طريق رصد موقف حبة. وتستخدم طول الخلافات بين الحمض النووي المفرد الذين تقطعت بهم السبل ، ومضاعفة للحصول على معلومات في الوقت الحقيقي على النشاط المتماثل من البروتينات عند مفترق الطرق. قياس موقف يسمح حبة التحديد الدقيق لمعدلات وprocessivities من الحمض النووي الفك والبلمرة (الشكل 2).
Protocol
Discussion
من المهم التأكد من أن قوة السحب التي تمارس على تدفق الصفحي الخرز التي لا تؤثر على الأنشطة الأنزيمية للبروتينات تكرارها. على سبيل المثال ، قوة PN 3 الذي يتوافق مع معدل تدفق 0.012 مل / دقيقة لا تؤثر على تكرار حبلا الحمض النووي الرائدة. ومع ذلك فإنه لا يؤثر على الأنشطة الأنزيم…
Acknowledgements
وقد ساعد تطور الحمض النووي التي تمتد مقايسة بلايني بول جونغ بونغ لي ، وسمير حمدان. ويؤيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح لتشارلز ريتشاردسون (GM54397) ، وأنطوان فان Oijen (GM077248).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bacteriophage λ DNA | New England Biolabs | N3011L | ||
| DNA Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | |||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | ||
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | ||
| α-digoxigenin Fab | Roche | 11214667001 | ||
| Tosyl Activated Beads | Dynal/Invitrogen | 142-03 | ||
| Magnetic Separator | Invitrogen | Dynal MPC | ||
| 3-aminopropyl-triethoxysilane | Sigma | A3648 | Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces | |
| Succinimidyl propionate PEG | Nektar | Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc. | ||
| Biotin-PEG-NHS | Nektar | Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc. | ||
| Double-sided tape | Grace BioLabs | SA-S-1L | 100 μm thickness | |
| Quartz slide | Technical Glass | 20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H) | Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net) | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson | 427416 | 0.76 mm ID, 1.22 OD Other size tubing can be substituted. |
|
| Streptavidin | Sigma | S4762 | Make 1 mg/mL solution, 25 μL aliquots in PBS pH 7.3 | |
| Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix | New England Biolabs | N0447 | ||
| Inverted Optical Microscope with 10X Objective | Olympus | Olympus IX-51 | ||
| Permament rare-earth magnet | National Imports | www.rare-earth-magnets.com | ||
| CCD Camera | QImaging | Rolera-XR Fast 139 | ||
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 11 Plus | Operate in refill mode to facilitate solution changes | |
| Fiber Illuminator | Thorlabs Inc. | OSL1 |
Referências
- Lee, J. B. DNA primase acts as a molecular brake in DNA replication. Nature. 439, 621-624 (2006).
- Tanner, N. A., van Oijen, A. M. Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication. Methods Mol Biol. 521, 397-410 (2009).
- Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption. Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).
- Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. J Vis Exp. , (2009).
- Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis. Nature. 457, 336-339 (2009).
- van Oijen, A. M. Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder. Science. 301, 1235-1238 (2003).
