我们描述了一个观察单个DNA分子介导的蛋白质的噬菌体复制系统的实时复制的方法。
我们描述了一个观察单个DNA分子介导的蛋白质的噬菌体复制系统的实时复制的方法。线性λDNA被修改,有一个链上的生物素,地高辛基团上的同一条电缆的另一端。生物素标记的一端连接到一个官能的玻璃盖玻片和digoxigeninated结束的小珠。一个流细胞表面上这些DNA珠系绳大会允许应用层流珠施加的阻力。因此,被拉伸的DNA靠近和平行的流量(图1)确定力在盖玻片表面。测量长度的DNA监测珠的位置。单双链DNA之间的长度差异,利用获得的实时信息,在交岔路口的复制蛋白的活性。测量珠的位置可以精确测定平仓DNA和聚合(图2)的速率和processivities。
重要的是要确保对珠层流曳力不影响酶活性的复制蛋白。举例来说,一个3 PN的力量,对应到0.012毫升/分钟的流速不影响复制的DNA领先链。但它的影响,采取协调DNA合成过程中酶的活性,因此将减少到1.5 PN。拖曳力可以很容易地控制,通过改变流速或流道 5的宽度。
DNA拉伸实验采用双和单链DNA之间的长度差异。在实验中所描述这里的单链DNA双链DNA转换作为一个领先的?…
拉伸实验的DNA的发展援助,钟奉李保布莱尼和萨米尔哈姆丹。这项工作是由美国国立卫生赠款查尔斯理查德森(GM54397),安托万车Oijen(GM077248)研究院的支持。