תצפית ישירה של ה-DNA אנזימים שכפול באמצעות DNA מולקולה בודדת מתיחה Assay
Summary
אנו מתארים שיטה התבוננות שכפול בזמן אמת של מולקולות דנ"א בודדות מתווכת על ידי חלבונים של מערכת שכפול bacteriophage.
Abstract
אנו מתארים שיטה התבוננות שכפול בזמן אמת של מולקולות דנ"א בודדות מתווכת על ידי חלבונים של מערכת שכפול bacteriophage. לינארית λ-DNA הוא שונה יש ביוטין על קצה חוט אחד, מחצית digoxigenin בצד השני של גדיל אחד. סוף biotinylated מחובר coverslip כוס פונקציונליות לבין סוף digoxigeninated כדי חרוז קטן. הרכבה של אלה-DNA חרוז חבלים על פני השטח של התא זרימה מאפשר זרימה למינרית להיות מיושם להפעיל כוח לגרור על החרוז. כתוצאה מכך, ה-DNA הוא נמתח קרוב ובמקביל פני השטח של coverslip לעבר הכוח אשר נקבעת על ידי קצב הזרימה (איור 1). אורכו של ה-DNA נמדד על ידי ניטור את המיקום של החרוז. הבדלי אורך בין דנ"א יחיד ו פעמיים תקועים מנוצלים לקבל מידע בזמן אמת על פעילות החלבונים שכפול במזלג. מדידת המיקום של החרוז מאפשר קביעה מדויקת של שיעורי processivities של ה-DNA ואת ההתרה פילמור (איור 2).
Protocol
Discussion
חשוב להבטיח כי כוח הגרר המופעל על ידי זרימה למינרית חרוזים אינו משפיע על פעילות אנזימטית של חלבונים שכפול. למשל, כוח 3 PN המתאים קצב זרימה של 0.012 ml / min לא משפיע השכפול של גדיל DNA מובילים. היא עושה זאת להשפיע על הפעילות האנזימטית המתרחשים במהלך סינתזת DNA מתואמת, ולכן יש לצמ?…
Acknowledgements
הפיתוח של ה-DNA מתיחה assay נעזרה פול Blainey, בונג ג'ונג לי, סמיר חמדאן. עבודה זו נתמכת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים לצ'ארלס ריצ'רדסון (GM54397) ואנטואן ואן Oijen (GM077248).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bacteriophage λ DNA | New England Biolabs | N3011L | ||
| DNA Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | |||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | ||
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | ||
| α-digoxigenin Fab | Roche | 11214667001 | ||
| Tosyl Activated Beads | Dynal/Invitrogen | 142-03 | ||
| Magnetic Separator | Invitrogen | Dynal MPC | ||
| 3-aminopropyl-triethoxysilane | Sigma | A3648 | Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces | |
| Succinimidyl propionate PEG | Nektar | Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc. | ||
| Biotin-PEG-NHS | Nektar | Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc. | ||
| Double-sided tape | Grace BioLabs | SA-S-1L | 100 μm thickness | |
| Quartz slide | Technical Glass | 20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H) | Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net) | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson | 427416 | 0.76 mm ID, 1.22 OD Other size tubing can be substituted. |
|
| Streptavidin | Sigma | S4762 | Make 1 mg/mL solution, 25 μL aliquots in PBS pH 7.3 | |
| Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix | New England Biolabs | N0447 | ||
| Inverted Optical Microscope with 10X Objective | Olympus | Olympus IX-51 | ||
| Permament rare-earth magnet | National Imports | www.rare-earth-magnets.com | ||
| CCD Camera | QImaging | Rolera-XR Fast 139 | ||
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 11 Plus | Operate in refill mode to facilitate solution changes | |
| Fiber Illuminator | Thorlabs Inc. | OSL1 |
Referências
- Lee, J. B. DNA primase acts as a molecular brake in DNA replication. Nature. 439, 621-624 (2006).
- Tanner, N. A., van Oijen, A. M. Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication. Methods Mol Biol. 521, 397-410 (2009).
- Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption. Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).
- Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. J Vis Exp. , (2009).
- Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis. Nature. 457, 336-339 (2009).
- van Oijen, A. M. Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder. Science. 301, 1235-1238 (2003).
