Direkt observation av enzymer Replikera DNA med en enda molekyl DNA Stretching analys
Summary
Vi beskriver en metod för att observation realtid replikering av enskilda DNA-molekyler förmedlas av proteiner från bakteriofag replikering systemet.
Abstract
Vi beskriver en metod för att observation realtid replikering av enskilda DNA-molekyler förmedlas av proteiner från bakteriofag replikering systemet. Linjäriserade λ DNA är modifierad så den har en biotin på slutet av en tråd, och en digoxigenin fraktionen i andra änden av samma tråd. Den biotinylerad änden är ansluten till en functionalized glas täckglas och digoxigeninated slut på en liten pärla. Monteringen av dessa DNA-sträng tjuder på ytan av ett flöde cell gör ett laminärt flöde som skall tillämpas för att utöva en dragkraft på pärlan. Som ett resultat, är DNA sträcks nära och parallellt med ytan på täckglas vid en kraft som bestäms av flödet (Figur 1). Längden på DNA mäts genom att övervaka läget för pärla. Längd skillnader mellan enkel-och dubbelsträngat DNA används för att få information i realtid om verksamheten för replikering proteiner på gaffeln. Mätning av läge pärla ger en exakt bestämning av priser och processivities av DNA varva ner och polymerisation (figur 2).
Protocol
Discussion
Det är viktigt att se till att dra kraft som verkar på pärlor med laminärt flöde inte påverkar enzymaktiviteten av replikering proteiner. Till exempel påverkar ett 3 pn-kraft som motsvarar ett flöde på 0,012 ml / min inte replikering av DNA ledande strängen. Det påverkar dock enzymatisk aktiviteter som äger rum under samordnad DNA-syntes, och det måste därför reduceras till 1,5 PN. Den dragkraft kan enkelt kontrolleras genom att ändra flödet eller en bredd av flödet kanal 5.
<p class="jo…Acknowledgements
Utvecklingen av DNA-stretching analysen fick hjälp av Paul Blainey, Jong-Bong Lee, och Samir Hamdan. Detta arbete stöds av National Institutes of Health bidrag till Karl Richardson (GM54397), och Antoine van Oijen (GM077248).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bacteriophage λ DNA | New England Biolabs | N3011L | ||
| DNA Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | |||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | ||
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | ||
| α-digoxigenin Fab | Roche | 11214667001 | ||
| Tosyl Activated Beads | Dynal/Invitrogen | 142-03 | ||
| Magnetic Separator | Invitrogen | Dynal MPC | ||
| 3-aminopropyl-triethoxysilane | Sigma | A3648 | Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces | |
| Succinimidyl propionate PEG | Nektar | Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc. | ||
| Biotin-PEG-NHS | Nektar | Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc. | ||
| Double-sided tape | Grace BioLabs | SA-S-1L | 100 μm thickness | |
| Quartz slide | Technical Glass | 20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H) | Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net) | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson | 427416 | 0.76 mm ID, 1.22 OD Other size tubing can be substituted. |
|
| Streptavidin | Sigma | S4762 | Make 1 mg/mL solution, 25 μL aliquots in PBS pH 7.3 | |
| Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix | New England Biolabs | N0447 | ||
| Inverted Optical Microscope with 10X Objective | Olympus | Olympus IX-51 | ||
| Permament rare-earth magnet | National Imports | www.rare-earth-magnets.com | ||
| CCD Camera | QImaging | Rolera-XR Fast 139 | ||
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 11 Plus | Operate in refill mode to facilitate solution changes | |
| Fiber Illuminator | Thorlabs Inc. | OSL1 |
Referências
- Lee, J. B. DNA primase acts as a molecular brake in DNA replication. Nature. 439, 621-624 (2006).
- Tanner, N. A., van Oijen, A. M. Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication. Methods Mol Biol. 521, 397-410 (2009).
- Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption. Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).
- Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. J Vis Exp. , (2009).
- Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis. Nature. 457, 336-339 (2009).
- van Oijen, A. M. Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder. Science. 301, 1235-1238 (2003).
