Summary
هذا الفيديو يوضح بروتوكول لفحص الأوعية الدموية في المختبر الذي يلخص مراحل عديدة من الأوعية الدموية. وتظهر -- الوقت الفاصل بين الصور التي تنتشر من وتشكيل التجويف ، والمتفرعة مفاغرة -- الملامح الرئيسية الأوعية الدموية.
Abstract
الأوعية الدموية هي عملية معقدة متعددة الخطوات العملية ، حيث ، وذلك استجابة لمحفزات عائية ، يتم إنشاء السفن الجديدة من الأوعية الدموية الموجودة. وتشمل هذه الخطوات : تدهور انتشار الطابق السفلي ، والغشاء والهجرة (تنبت) من الخلايا البطانية (EC) في المصفوفة خارج الخلية ، والمحاذاة من المفوضية الأوروبية في الحبال ، المتفرعة ، وتشكيل التجويف ، مفاغرة ، وتشكيل الغشاء القاعدي الجديد. وقد وضعت العديد من فحوصات المختبر لدراسة هذه العملية ، ولكن معظم فقط تحاكي مراحل معينة من الأوعية الدموية ، وتتشابه هذه السفن في المقايسات في كثير من الأحيان لا تشبه السفن في الجسم الحي. استنادا إلى الأعمال السابقة التي Nehls وDrenckhahn ، وقد الأمثل لدينا خبير في الفحص المختبري الأوعية الدموية التي تستخدم الإنسان السري EC الوريد والليفية. يلخص هذا النموذج جميع المراحل المبكرة من الأوعية الدموية الرئيسية ، والأهم ، والسفن عرض براءات الاختراع بين الخلايا شمعة محاطة EC الاستقطاب. والمغلفة EC على microcarriers cytodex وجزءا لا يتجزأ الى هلام الليفين. والطبقات الليفية على رأس الجل حيث أنها توفر العوامل اللازمة للذوبان التي تشجع المفوضية الأوروبية التي تنتشر من سطح الخرز. بعد عدة أيام ، والعديد من السفن موجودة التي يمكن بسهولة أن يلاحظ التباين في إطار المرحلة والمجهري مرور الزمن. هذا الفيديو يوضح الخطوات الأساسية في إعداد هذه الثقافات.
Protocol
تحضير الخلايا
- إحضار HUVEC والخلايا الليفية في M199/10 ٪ FBS / PEN - بكتيريا (1:100) 1-2 قبل أيام من الديكور.
- التبديل المتوسط إلى EGM - 2 (Clonetics) قبل يوم واحد لHUVEC الديكور والنهار قبل التضمين لالليفية.
- وهناك حاجة إلى تركيز ~ 400 حبة في HUVEC.
- هناك حاجة إلى 20000 الليفية لكل بئر.
طلاء مع الخرز HUVEC -- -1 اليوم
- يعرض للتريبسين HUVEC.
- السماح لتسوية الخرز (DO NOT الطرد المركزي!). نضح في وطاف تغسل حبات لفترة وجيزة في 1 مل من المتوسط EGM - 2 الدافئة.
- مزيج 2500 الخرز ث / 6 1X10 HUVEC في 1.5 مل من المتوسط الدافئة EGM - 2 في أنبوب FACS. وضعه في الحاضنة عموديا. (هذا سوف يكون كافيا ل~ 10 بئرا. مقياس اذا اقتضت الضرورة)
- احتضان لمدة 4 ساعات في 37 درجة مئوية ، والهز الأنبوب كل 20 دقيقة. (طلاء جيد أمر حاسم لتنبت).
- بعد 4 ساعات ، نقل حبات المغلفة لقارورة في 5mL T25 - 2 من الجمعية العمومية غير العادية وترك O / N.
التضمين BEADS المغلفة في GEL الليفين -- يوم 0
- إعداد الحل الفيبرينوجين 2.0 ملغ / مل (انظر القسم صفة).
- إضافة 0.15 وحدات / مل من أبروتينين في حل الفيبرينوجين.
- نقل حبات المغلفة لأنبوب مخروطي 15mL والسماح حبات تسوية. Resuspend حبات من الجمعية العمومية غير العادية في 1mL - 2 ، ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5mL.
- تغسل حبات 3X مع 1mL من الجمعية العمومية غير العادية التي pipeting - 2 صعودا ونزولا ببطء.
- عد حبات على ساترة وresuspend في حل الفيبرينوجين في تركيز حبات 500 ~ / مليلتر.
- إضافة 0.625 وحدة / مل من كل بئر إلى ثرومبين.
- إضافة 0.5 مل من تعليق الفيبرينوجين / حبة من كل بئر من لوحة ال 24 أيضا.
تغيير تلميح ماصة لكل بئر! - مزيج ثرومبين والفيزيولوجية في طريق الذهاب صعودا وهبوطا بلطف مع طرف ماصة ~ 4 الى 5 مرات. يجب الحرص على عدم جعل فقاعات كبيرة.
- ترك لوحة لمدة 5 دقائق في غطاء محرك السيارة ، ثم ضع في ال 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة حاضنة لتوليد جلطة.
- في انتظار الجلطة يعرض للتريبسين الليفية.
- إضافة 1 مل من EGM - 2 لكل بئر قطرة الحكيمة.
- الليفية البذور على أعلى من هلام الليفين بتركيز 20000 خلايا لكل بئر.
ملاحظات :
عادة ، عندما يتم تشكيل هلام الليفين ، سوف ترى فقاعات صغيرة في هلام. لا تقلق ، سوف تختفي في أيام 3-4.
تغيير وسائل الإعلام كل يوم ، أي يوم 2 ، 4 ، 6 ، الخ...
بعد يوم 3 أو 4 يجب أن تبدأ لرؤية تبرعم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك إجماع متنام بأن ثلاثية الأبعاد (3D) في الأوعية الدموية فحوصات المختبر تقديم نموذج الذي هو أقرب إلى البيئة الفعلية في الجسم الحي مما يمكن تحقيقه باستخدام 2D الثقافات. فمن الواضح أن نظم 3D متفوقة ينبغي استنساخه ، وتكون قادرة على محاكاة العديد من الخطوات الرئيسية في الأوعية الدموية. في حين وضعت عدة فحوصات 3D السابقة ، الكثير من هؤلاء إما استخدام يصعب الحصول على خلايا الاوعية الدموية الدقيقة ، أو فقط ألخص بعض المراحل. في هذا الفيديو ، وصفنا ، وإجراء الفحص الأمثل في الأوعية الدموية التي تستخدم المختبر السري الإنسان الأوروبية الوريد ، والتي يمكن الحصول عليها بسهولة والمفوضية الأوروبية الأكثر استخداما في البحث في الأوعية الدموية. والفحص ، على مدى عدة أيام ، وتستنسخ باستمرار السفن شمعة طويلة مع البراءة واضحة ، بين الخلايا محاطة EC الاستقطاب. ويلاحظ أيضا مراحل لاحقة من المفوضية الأوروبية والانصهار المتفرعة من السفن (مفاغرة). الأهم من ذلك ، في هذه الثقافات HUVEC تخضع كافة التغييرات الشكلية التي تعتبر المفوضية الأوروبية مع الاوعية الدموية الدقيقة ، سواء في الجسم الحي أو في المختبر ، بما في ذلك تنتشر ، والهجرة ، وتشكيل محاذاة الانتشار ، أنبوب ، والمتفرعة مفاغرة. ملف التعبير الجيني للتغيرات HUVEC ، بالتوازي ، على نحو أوثق من المباراة التي EC الاوعية الدموية الدقيقة. في الختام ، نتقدم بروتوكول الأمثل لنموذج الأوعية الدموية في المختبر الذي يلخص مراحل هامة عدة من هذه العملية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytodex-3 Beads | Reagent | Amersham | 17-0485-01 | 10 g/bottle. 1.0.5 g of dry beads are hydrated and swollen in 50 mL PBS (pH = 7.4) for at least 3 h at RT. Use a 50 mL tube and place it on the rocker.2.Let the beads settle down (~ 15 min). Discard the supernatant and wash the beads for a few minutes in fresh PBS (50 mL).3.Discard the PBS and replace with fresh PBS:25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL or 50 mL -> 10 mg/mL => 30,000 beads/ mL4.Place the bead suspension in a siliconized glass bottle (Windshield Wiper or Sigmacote).5.Sterilize the beads by autoclaving for 15 min at 115°C.6.Store it at 4°C. |
| Aprotinin | Reagent | Sigma-Aldrich | A-1153 | 10 mg/bottle. Reconstitute lyophilized aprotinin at 4 U/mL in DI water. Sterile filter. Make aliquots of 1 mL each. Store at -20 °C. |
| Fibrinogen Type I | Reagent | Sigma-Aldrich | F-8630 | 1 g. Dissolve 2 mg/mL fibrinogen in DPBSNote clottable protein % and adjust accordingly Heat in a 37 °C-water bath to dissolve the fibrinogen. Mix by inverting the tube. Do not vortex.Sterile filter through 0.22 um |
| Thrombin | Reagent | Sigma-Aldrich | T-3399 | 22 mg = 1,000 units. Reconstitute in sterile water at 50 U/mL. Make aliquots of 0.5 mL each. Store at -20 °C. |
References
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro. Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).
