Summary
Wir stellen einen neuartigen Ansatz für die Zwei-Photonen-Mikroskopie der Tumorabgabe von fluoreszenzmarkierten Eisenoxid-Nanopartikeln an das Glioblastom in einem Mausmodell vor.
Abstract
Die Verabreichung von intravenös verabreichten Krebstherapeutika an Hirntumoren ist durch die Blut-Hirn-Schranke begrenzt. Eine Methode zur direkten Abbildung der Akkumulation und Verteilung von Makromolekülen in Hirntumoren in vivo würde unsere Fähigkeit, die Wirkstoffabgabe in präklinischen Modellen zu verstehen und zu optimieren, erheblich verbessern. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Echtzeit-In-vivo-Verfolgung von intravenös verabreichten fluoreszenzmarkierten Nanopartikeln mit Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie (2P-IVM) in einem Mausmodell des Glioblastoms (GBM).
Das Protokoll enthält eine mehrstufige Beschreibung des Verfahrens, einschließlich Anästhesie und Analgesie von Versuchstieren, Schaffung eines Schädelfensters, GBM-Zellimplantation, Platzierung einer Kopfstange, Durchführung von 2P-IVM-Studien und postoperativer Versorgung für Langzeit-Follow-up-Studien. Wir zeigen repräsentative 2P-IVM-Bildgebungssitzungen und Bildanalysen, untersuchen die Vor- und Nachteile dieser Technologie und diskutieren mögliche Anwendungen.
Diese Methode kann leicht modifiziert und für verschiedene Forschungsfragen im Bereich der präklinischen Hirnbildgebung in vivo angepasst werden.
Introduction
Die Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie (2P-IVM) ist ein Fluoreszenzbildgebungsverfahren, das die Visualisierung von lebendem Gewebeermöglicht 1.
2P-IVM wurde erstmals in den 1990er Jahren entwickelt und wurde für die In-vivo-Analyse der Netzhaut2, der Niere3, des Dünndarms4, der Cochlea5, des Herzens6, der Luftröhre7 und des Gehirns in verschiedenen präklinischen Modellen verwendet 8,9. Im Bereich der Neurowissenschaften hat 2P-IVM als Technik für die Echtzeit-Bildgebung des gesunden Gehirns bei wachen Tierenan Bedeutung gewonnen 10 sowie zur Untersuchung von Erkrankungen des Nervensystems wie Alzheimer11, Parkinson12 und Glioblastom (GBM)13,14,15,16.
2P-IVM bietet eine elegante Lösung für die Untersuchung der Tumormikroumgebung während der Entwicklung von GBM. Während sich einige frühere Studien auf In-vitro-17- und Ex-vivo-Modelle 18 konzentrierten, implementierten andere orthotopische19- und xenotrope20-In-vivo-Modelle zur Untersuchung von GBM. Madden et al. führten eine native Bildgebung der CNS-1-Rattengliomzelllinie in einem Mausmodelldurch 13. Unter Verwendung eines orthotopen GL261-DsRed-Mausmodells führten Ricard et al. eine intravenöse Verabreichung eines Fluorophors durch, um die Blutgefäße in der Tumorregion in 2P-IVM14 zu verbessern.
Hier wenden wir 2P-IVM an, um die Tumorabgabe von fluoreszenzmarkierten Eisenoxid-Nanopartikeln (NP) in einem orthotopen Mausmodell von GBM zu verfolgen. Mit Hilfe eines kranialen Fensters können wir mit dieser Methode die räumlich-zeitliche Verteilung von NPs im Gehirn in Echtzeit im Detail untersuchen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Das in diesem Protokoll beschriebene Tierverfahren entspricht den Anforderungen des Verwaltungsgremiums für die Behandlung von Versuchstieren (APLAC).
1. Zellkultur
- Vorbereitung der Haube
- Waschen Sie sich die Hände, tragen Sie Handschuhe und einen Laborkittel. Schalten Sie die biologische Sicherheitswerkbank ein und stellen Sie die Flügelhöhe auf eine geeignete Öffnungshöhe ein. Lassen Sie die Haube 3-5 Minuten lang reinigen. Besprühen Sie den Haubenbereich mit 70% Ethanol und wischen Sie ihn mit Seidenpapier ab.
- Besprühen Sie alle Reagenzien mit 70% Ethanol und wischen Sie sie mit Seidenpapier ab. Bewegen Sie die Reagenzien in die Haube. Legen Sie keine Gegenstände auf den Grill. Wenn in der Motorhaube etwas verschüttet wird, decken Sie sie mit Tüchern ab, besprühen Sie sie mit 70% Ethanol und wischen Sie sie erneut ab.
- Schließen Sie nach dem Experiment vorsichtig die Deckel jedes Gegenstands, wischen Sie alle Materialien ab, entfernen Sie alle Gegenstände aus der Haube und bringen Sie sie an ihren ursprünglichen Platz. Sprühen Sie 70% Ethanol in die Motorhaube und wischen Sie es ab. Schließen Sie den Flügel und schalten Sie die biologische Sicherheitswerkbank aus.
- Vorbereitung eines Wachstumsmediums
- 50 ml 100% fötales Rinderserum (FBS) zu 500 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) geben. Fügen Sie 5 ml der antibiotisch-antimykotischen Lösung (100x) hinzu.
- Führen Sie alle Reagenzien durch eine sterile 500-ml-Filterflasche (0,22-μm-Filter).
- Auftauen von kryokonservierten Zellen
- Geben Sie in einer Laminar-Flow-Haube 20 ml des Wachstumsmediums in einen T75-Kolben. Beschriften Sie den Kolben mit dem Namen der Zellen, dem Datum und der Durchgangsnummer auf dem Kolben. In dieser Studie wurden adhärente C6-Gliomzellen verwendet.
- Zellen schnell in einem 37 °C warmen Wasserbad auftauen. Wirbeln Sie die Zellen nicht. Auftauen und die Zellen sofort verwenden.
- Die aufgetauten Zellen werden mit einer 1-ml-Pipettenspitze in den T75-Kolben überführt. Achten Sie darauf, dass während des Umfüllvorgangs keine Blasen entstehen, und vermeiden Sie mittlere Rückstände im Flaschenhals. Dies könnte das Risiko einer möglichen Kontamination erhöhen.
- Wechseln des Mediums
- Wechseln Sie das Medium am Tag nach dem Auftauen, um Trypsin- oder Dimethylsulfoxidreste (DMSO) zu entfernen (Schritt 1.6). Wechseln Sie danach das Medium mindestens zweimal pro Woche oder öfter, je nach Zellkonfluenzgrad. Das Medium muss einen Tag nach der Passage gewechselt werden, um Trypsin zu eliminieren.
- Um das Medium zu wechseln, schalten Sie das Aspirationsgerät ein, bringen Sie die Aspirationsglaspipette an und saugen Sie das gesamte Medium an.
- Fügen Sie 20 ml des Wachstumsmediums hinzu (Schritt 1.2).
- Passieren der Zellen
- Beladen Sie die Haube mit den Gegenständen, die im Laufe des Experiments benötigt werden.
- Verwenden Sie eine Aspirationsglaspipette und saugen Sie alle Medien ab, wobei Sie sicherstellen, dass sich die Glaspipette auf der Nicht-Zellseite des Kolbens befindet. Positionieren Sie für diesen Schritt den T75-Kolben senkrecht.
- Fügen Sie ~10 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung bei Raumtemperatur (RT) (PBS, Ca++ und Mg++ frei) oder Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS, Ca++ und Mg++ frei) auf der Nicht-Zellseite hinzu. Die Zellen werden kurz mit PBS gewaschen, indem der T75-Kolben horizontal mit der Zellseite nach unten positioniert wird.
- Stellen Sie den Kolben sofort senkrecht auf und saugen Sie den PBS/HBSS an. Wiederholen Sie dieses Waschen und Aspirieren 3 Mal.
- 2 ml Trypsin (rekombinant oder tierischen Ursprungs) auf der Zellseite (T75-Kolben horizontal, Zellseite nach unten) zugeben. In einem Standard-Gewebekultur-Inkubator (37 °C, 5 % CO2) für 4 min inkubieren. Zerreiben Sie es einmal nach 2 Minuten mit einer 5-ml-Pipette.
- Nach 4 Minuten Gesamtinkubation die Lösung in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführen. Geben Sie 8 ml der Wachstumslösung in das konische Röhrchen (2 ml trypsinisierte Zellen + 8 ml Medium = insgesamt 10 ml).
- Verwenden Sie ein weiteres leeres konisches 15-ml-Röhrchen mit einem Filter und übertragen Sie die Zellen über eine 25-ml-Pipette, um einzelne Zellen zu erhalten.
- 1/10 (1 ml) der Lösung (Zelle + Medium + Tryp-LE) wird in einen T75-Kolben mit 20 ml Medium überführt. Alternativ können Sie die Zellen zählen (Schritt 1.7). Wechseln Sie das Medium am nächsten Tag, um eine Nicht-Trypsin-Medienlösung zu erhalten.
- Einfrieren des Mediums und der Zellen
- 100% FBS im 4 °C Kühlschrank auftauen. Verwenden Sie kein Wasserbad oder Hitze, da dies die Proteine in FBS beschädigen kann.
- Um 50 ml Gefriermedium zuzubereiten, mischen Sie 45 ml DMEM, 5 ml FBS und 5 ml DMSO. Aliquotieren Sie es in 1-2 ml-Behälter, um intermittierendes Auftauen und Proteinschäden zu vermeiden. Lagern Sie sie in einem Gefrierschrank von -20 ° oder -80 °C.
- Für die restlichen 9 ml Lösung (Schritt 1.5) fügen Sie 1 ml Medium hinzu, um insgesamt 10 ml zu erreichen. Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 4 min.
- Überstand entfernen und in 1 ml Gefriermedium resuspendieren (siehe oben). Legen Sie die Zellen in einen Gefrierbehälter im -80 °C Gefrierschrank. Bringen Sie die Zellen nach 1 oder 2 Tagen zur Langzeitlagerung in flüssiges N2 .
- Zählen der Zellen
- Fügen Sie für die verbleibenden 9 ml (Schritt 1.5) 1 ml Medium hinzu, um insgesamt 10 ml zu erreichen. Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 4 min.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie ihn in 4 ml HBSS. Resuspendieren Sie 10 μl Zellen in 80 μl HBSS + 10 μl 0,4% Trypanblau, Verdünnungsfaktor = 10.
- Nehmen Sie 17 μl der Lösung und zählen Sie vier 4 x 4 Quadrate in einem Hämozytometer. Durchschnittliche Zählungen für die vier 4 x 4-Quadrate und multiplizieren Sie mit 104x Verdünnungsfaktor, um Zellen/ml zu erhalten.
2. Chirurgie
HINWEIS: Es wird empfohlen, die Operation von zwei Forschern durchzuführen, wobei eine Person für die Vorbereitung der Zellen, das Mischen des Zahnzements und die allgemeine Unterstützung des Eingriffs verantwortlich ist, während sich die zweite Person darauf konzentriert, steril zu bleiben. Ein zweiter Manipulator zur Unterstützung des chirurgischen Eingriffs reduziert die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination erheblich. Die Befolgung der besten chirurgischen Praktiken würde die Wahrscheinlichkeit postoperativer Komplikationen verringern. Abbildung 1A gibt einen Überblick über die Komponenten des Schädelfensters.
- Allgemeine Vorbereitungen
- Vergewissern Sie sich, dass das Verfahren von den örtlichen Richtlinien der Tierschutzinstitution genehmigt wurde, bevor Sie beginnen.
HINWEIS: In dieser Studie wurden 5 Monate alte weibliche NSG-Mäuse (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) (n = 5). - Autoklavieren Sie vor der Operation alle chirurgischen Instrumente und stellen Sie sicher, dass alle notwendigen Vorräte verfügbar sind. Drucken Sie die Anästhesie- und Operationsunterlagen aus.
- Stellen Sie sicher, dass die Tiere bei ihrer Ankunft mindestens 1 Woche Zeit haben, sich an den Tierhaltungsraum zu gewöhnen, um zusätzliche postoperative Belastungen zu reduzieren.
- Stellen Sie am Tag der Operation sicher, dass alle Geräte (Mikroskop, Heizkissen, Sterilisator, Bohrer, Vakuum usw.) einsatzbereit sind. Vergewissern Sie sich, dass das Anästhesiegerät genügend Isofluran enthält, und füllen Sie es bei Bedarf nach. Für neue Benutzer kann das Schädelfensterverfahren bis zu 2 Stunden pro Tier dauern; Daher ist es entscheidend, genügend Isofluran zu haben.
- Legen Sie die Glasfenster und Kopfstangen in Alkohol und bereiten Sie einen Behälter mit Kochsalzlösung vor. Dies gewährleistet einen reibungslosen Arbeitsablauf ohne größere Sterilitätsverletzungen und hält die Narkosezeit für jedes Tier so kurz wie möglich.
- Öffnen Sie alle chirurgischen Materialien auf einer sterilen Oberfläche am Arbeitsplatz. Hierfür kann beispielsweise die Innenseite einer sterilen Mullverpackung genutzt werden. Verwenden Sie die Technik nur mit Tipps. Wenn Sie keine chirurgischen Instrumente verwenden, legen Sie die Spitzen auf eine sterile Oberfläche, z. B. auf die Innenseite der Verpackung aus steriler Gaze.
- Legen Sie bei mehreren Operationen alle chirurgischen Instrumente zwischen den Operationen in den Sterilisator, um sie zu desinfizieren. Wenn Sie Operationen an mehr als 5 Tieren durchführen, verwenden Sie einen neuen Satz autoklavierter Instrumente. Tauschen Sie die Bohrerspitze aus, wenn sie stumpf wird, um ein Gewebetrauma zu vermeiden.
- Vergewissern Sie sich, dass das Verfahren von den örtlichen Richtlinien der Tierschutzinstitution genehmigt wurde, bevor Sie beginnen.
- Anästhesie und Operationsvorbereitungen
HINWEIS: Das Anästhesie-Setup ist sowohl für die Operation als auch für die Bildgebung identisch.- Betäuben Sie die Maus mit Isofluran (3%-5% für die Induktion) in einer Anästhesiekammer. Nachdem das Tier durch Testen des Pedalrückzugsreflexes (Fußpolsterkneifen an beiden Hinterfüßen) eine ausreichende Anästhesietiefe sichergestellt hat, wird es zu einer Vorbereitungsarbeitsstation gebracht. Halten Sie die Anästhesie über einem Nasenkegel aufrecht (1%-2%). Tragen Sie hier eine Augensalbe auf, um Hornhautschäden vorzubeugen. Kontrollieren Sie regelmäßig den Verlust von Reflexen während der Operation, indem Sie den Pfotenreflex überprüfen.
- Wenn eine Identifizierung des Tieres erforderlich ist, verwenden Sie ein Ohrlochwerkzeug oder eine Schere, um die Ohren zu markieren, oder verwenden Sie einen Marker, um den Schwanz zu markieren.
- Entfernen Sie das Fell, das den Schädel zwischen Ohren und Augen bedeckt, mit einer Enthaarungscreme. Lassen Sie die Creme so lange wie vom Hersteller angegeben (30-60 s), um Hautreizungen zu vermeiden. Achten Sie darauf, dass die Creme mit den Haarwurzeln in Kontakt kommt, indem Sie sie entgegen der Haarwuchsrichtung auftragen. Vermeiden Sie, dass die Enthaarungscreme mit den Augen in Berührung kommt. Entfernen Sie Creme und Haarreste, indem Sie den Bereich mit Kochsalzlösung reinigen. Alternativ können Sie eine Haarschneidemaschine verwenden.
- Um intra- und postoperative Schmerzen, Infektionen oder Schwellungen zu vermeiden, verabreichen Sie nichtsteroidale Antirheumatika (NSAIDs), Opioide, entzündungshemmende Mittel und Antibiotika. Carprofen (5-20 mg/kg, subkutan [SQ]), Buprenorphin - verzögerte Freisetzung (1 mg/kg SQ), Cefazolin (20 mg/kg SQ) und Dexamethason (0,2 mg/kg SQ) vor der Operation verabreichen. Verabreichen Sie ca. 0,3 ml 0,9% Kochsalzlösung SQ, um Austrocknung zu vermeiden.
- Anschließend schrubben Sie den Bereich, indem Sie abwechselnd dreimal in kreisenden Bewegungen von der Schädelmitte zur Peripherie Povidon-Jod und Isopropylalkohol abtupfen.
- Kraniotomie-Verfahren
- Bringen Sie das Tier auf den Operationstisch und legen Sie es ventral auf ein Heizkissen (~37 °C), um isotherme Bedingungen während des Eingriffs zu gewährleisten. Hypothermie bei Nagetieren reduziert die Überlebensraten erheblich und verlängert die postoperative Erholungsphase.
- Platzieren Sie den Kopf im stereotaktischen Rahmen, indem Sie die Ohrbügel und Schneidezähne positionieren. Suchen Sie für die Ohrbügel den Jochbogen und setzen Sie die Stege hinter den Bögen ein. Beginnen Sie damit, die kontralaterale Stange mit der dominanten Hand zu sichern (z. B. die linke Stange mit der rechten Hand zu sichern, wenn Sie Rechtshänder sind) und sichern Sie dann die gegenüberliegende Seite. Passen Sie die Positionen des Ohrs und der Schneidezahnstangen bei Bedarf durch Drehen der Schrauben an.
- Tragen Sie bei Bedarf erneut Augensalbe auf und bedecken Sie die Augen mit einem Stück Alufolie. Dadurch werden Schäden durch das helle Mikroskoplicht und das UV-Licht, mit dem der Cyanacrylatkleber später ausgehärtet wird, vermieden (Schritt 2.5).
- Überprüfen Sie vor dem Einschnitt erneut den Zehenklemmreflex. Passen Sie die Anästhesie bei Bedarf entsprechend an. Verbinden Sie das Tier mit dem Anästhesieüberwachungsgerät, indem Sie den Sensor an der Hinterpfote positionieren. Die Messung der Herzfrequenz und der Blutsauerstoffkonzentration würde dazu beitragen, die Sterblichkeit zu senken und die postoperative Genesung zu verbessern. Erfassen Sie zusätzlich die Atemfrequenz, indem Sie die Brustbewegung visuell inspizieren.
- Decken Sie den Körper des Tieres mit einem Tuch ab, um Unterkühlung und Kontamination zu vermeiden. Führen Sie vor Beginn der Operation einen letzten Povidon-Jod-Tupfer durch.
- Ziehen Sie Handschuhe und einen sauberen Laborkittel an.
HINWEIS: Die Verwendung steriler Handschuhe wird aufgrund der Invasivität des Verfahrens und zur Verringerung des Risikos einer postoperativen Infektion und Entzündung, die zu Morbidität und Verlust der Bildqualität bei 2P-IVM führt, empfohlen (Abschnitt 5). - Heben Sie die Haut am Schädel an und machen Sie einen Schnitt, indem Sie die Schere zwischen dem rechten Auge und dem Ohr halten und nach den Schnittspuren zur linken Seite des Schädels schneiden. Entfernen Sie den entstandenen runden Hautlappen.
HINWEIS: Abhängig von der interessierenden Region im Gehirn und der Fenstergröße können die Inzisionsstelle und der Durchmesser variieren. Die Größe des Einschnitts muss größer sein als der Durchmesser des Kopfes, um Platz für die Montage zu schaffen (Schritt 2.5). Bei Bedarf kann die Haut, die den Schnitt umgibt, sanft präpariert werden, um mehr Platz zu schaffen. - Entfernen Sie das Periost, indem Sie die Schädeloberfläche vorsichtig mit einer Skalpellklinge oder einer Mikrokürrette zerkratzen. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie das Periost um die Schädelnähte herum entfernen, da diese Bereiche zerbrechlich und anfälliger für Blutungen sind. Verwenden Sie Kochsalzlösung und einen Staubsauger, um den Operationsbereich frei von Schmutz zu halten. Kratzen Sie das Periost ein, um eine bessere Haftung auf dem Cyanacrylatkleber und dem Zahnzement zu gewährleisten (Schritt 2.5)
- Identifizieren Sie die Region des Gehirns, in der die Zellinjektion durchgeführt werden soll. Verwenden Sie dazu einen Atlas der stereotaktischen Koordinaten des Mäusegehirns. Markieren Sie anhand der Gehirnkoordinaten die Position des Schädelfensters mit einem Biopsiestempel im gleichen Durchmesser wie das Fenster, einem chirurgischen Stift oder einem autoklavierten Bleistift.
- Halten Sie den Bohrer in der dominanten Hand und alle anderen Instrumente (Spritze, Pinzette) in der nicht dominanten Hand. Vermeiden Sie längeres Bohren an derselben Stelle. Der Bohrer sollte in Stößen verwendet werden, um eine Überhitzung zu vermeiden. Tragen Sie während dieser Pausen kalte Kochsalzlösung auf das Schädeldach auf, um die chirurgische Sicht sauber zu halten und eine Überhitzung zu vermeiden. Verwenden Sie das sensorische Feedback der Bohrspitze, um zu erkennen, wann der Schädel vollständig perforiert wurde.
- Verwenden Sie kalte Kochsalzlösung in Kombination mit einem Staubsauger, um die Schädeloberfläche zu reinigen. Verwenden Sie nach dem Öffnen des Schädeldachs keine Gaze oder einen Wattestäbchenapplikator, da Reste von Baumwollfäden beim Versiegeln des Gehirnfensters zu einer Fremdkörperreaktion führen können.
- Achten Sie beim Bohren darauf, dass die Flugbahn und der Durchmesser die gleiche Größe wie die des Glasdeckglases haben. Positionieren Sie dazu das Glasdeckglas auf dem Schädel und vergewissern Sie sich, dass das Glasdeckglas genau in das Schädelfenster passt.
- Sobald es möglich ist, den Schädellappen durch sanften Druck zu drücken, entfernen Sie das Fragment vorsichtig mit einer Pinzette aus dem Operationsfeld (Abbildung 1B, links). Wenn es noch nicht möglich ist, den Schädel zu drücken, bohren Sie weiter in den Bereichen des Schädelfensters, die noch mit dem Rest des Schädels verbunden sind, und bewerten Sie sie neu.
- Wenn leichte Blutungen auftreten, verwenden Sie einen hämostatischen Schwamm in Kombination mit leichtem Druck oder alternativ eiskalte Kochsalzlösung, um den Blutverlust zu reduzieren.
- Zellimplantation
- Bereiten Sie die zu implantierenden Zellen vor und zählen Sie sie wie in (Schritt 1.7) beschrieben. Stellen Sie sicher, dass die Zellzahl 200.000 Zellen/μl beträgt.
HINWEIS: Es wird empfohlen, die Zellen in einer Membranmatrix aufzuhängen, die sich bei RT verfestigt. Dadurch wird die Erfolgsrate der implantierten Zellen im Hirnparenchym verbessert. - Übertragen Sie die Zellen in einem Behälter mit Eis in den Operationssaal. Verwenden Sie eine gasdichte Mikroliterspritze. Lassen Sie die Spritze vor der Aspiration auf Eis, um Temperaturunterschiede zu vermeiden.
- Nach dem Absaugen von 1 μl positionieren Sie die Spritze innerhalb des stereotaktischen Rahmens.
HINWEIS: Ein automatisiertes stereotaktisches Koordinatengerät, das die Positionen in der X-, Y- und Z-Achse anzeigt, kann verwendet werden, um Zeit zu sparen. Es ist auch möglich, die Positionen auf Basis von Lambda manuell zu berechnen. Die Injektion von mehr als 1,5 μl wird nicht empfohlen. Dadurch wird sichergestellt, dass der injizierte Bereich nicht überfüllt wird, was zu einer erfolglosen Implantation, Wachstum außerhalb des Hirnparenchyms oder Metastasen führt. - Führen Sie eine Implantation in der V2MM-Region (visueller Kortex 2, mediomedialer Teil) des Gehirns durch, die ungefähr den Koordinaten medial bis lateral (M-L): -1,2 bis -1,6 mm und dorsal bis ventral (D-V): -2,6 bis -3,5 mm entspricht.
- Für die Zwei-Photonen-Bildgebung (Schritt 4.6) implantieren Sie die Zellen in die oberflächlichen Hirnareale, damit die Tumormasse später durch das Schädelfenster sichtbar gemacht werden kann. Injizieren Sie 0,5 μl (100.000 Zellen) von vorne nach hinten (A-P): 0,8 mm Tiefe. Bewegen Sie die Nadel langsam, schrittweise, wenn Sie in das Gehirn eintreten, und warten Sie 30 s nach der Injektion (Abbildung 1B, mittlere Spalte).
- Verwenden Sie den gleichen Ansatz, wenn Sie die Nadel zurückziehen und aus dem Hirngewebe austreten. Vermeiden Sie es, in der Nähe der Ventrikel zu injizieren, da die Zerebrospinalflüssigkeit Metastasen im zentralen und peripheren Nervensystem fördern kann.
- Bereiten Sie die zu implantierenden Zellen vor und zählen Sie sie wie in (Schritt 1.7) beschrieben. Stellen Sie sicher, dass die Zellzahl 200.000 Zellen/μl beträgt.
- Verschluss des Schädelfensters
- Bewegen Sie den Kopfbügel und das Glasdeckglas von Alkohol in eine Kochsalzlösung. Verwenden Sie eine Vakuumspitze oder Pinzette, um diese Komponenten zur Operationsstelle zu navigieren.
- Positionieren Sie das Glasdeckglas im Schädelfenster und geben Sie eine kleine Menge Cyanacrylatkleber zwischen den Schädel und das Glasdeckglas. UV-aktivierter Cyanacrylatkleber verkürzt die Aushärtungszeit und vermeidet versehentliche Verschiebungen. Wenn Kleber auf das Glasdeckglas verschüttet wird, entfernen Sie ihn mit einem Wattestäbchenapplikator oder kratzen Sie ihn vorsichtig mit der stumpfen Seite eines Skalpells ab, bevor er vollständig ausgehärtet ist.
ACHTUNG: UV-Licht ist schädlich für Augen und Haut. Vermeiden Sie Augen- und Hautkontakt beim Aushärten des Klebers. - Nachdem Sie das Glasdeckglas im Schädelfenster befestigt haben, setzen Sie die Kopfstange auf. Mischen Sie den Zweikomponenten-Zahnzement, positionieren Sie den Kopfbügel und tragen Sie den Zement auf die Umgebung auf, wobei Sie den Kontakt zwischen dem Schädel und dem Kopfbügel sicherstellen. Reinigen Sie überflüssigen Zement sorgfältig mit der Spitze einer Spritze, einem Skalpell oder einer Bohrspitze.
HINWEIS: Zahnzement verfestigt sich sehr schnell, daher wird empfohlen, ihn rechtzeitig aufzutragen. - Stellen Sie nach dem Versiegeln des Schädelfensters fest, ob noch Schädelbereiche zwischen Zahnzement und Haut freiliegen. Wenn dies der Fall ist, tragen Sie chirurgischen Kleber auf, um den Schädel zu bedecken, indem Sie die Haut schließen. Alternativ können Sie eine einzelne Naht mit einem resorbierbaren Nahtmaterial durchführen.
3. Postoperative Genesung und Tumorwachstum
- Genesung
- Überwachen Sie das Tier auf einem beheizten Kissen in einem Aufwachkäfig, bis es wieder bei vollem Bewusstsein ist. Bringen Sie die Tiere nach der Operation separat unter, um das Verletzungsrisiko zu verringern.
- Verabreichen Sie eine Erholungsdiät, wie z. B. handelsübliche Wassergele mit Elektrolyten oder Zuckern. Alternativ können Sie angefeuchtetes Standard-Laborfutter liefern, um eine einfache Ernährung zu gewährleisten und Dehydrierung und Hypoglykämie zu vermeiden.
- Überwachung
- Überwachen Sie das Tier nach der Genesung täglich auf Anzeichen von Schmerzen, Stress oder Infektionen. Verabreichen Sie bei Bedarf Analgetika, entzündungshemmende Medikamente oder Antibiotika. Wenn ein Tier den Endpunkt der Studie erreicht, wird es auf humane Weise eingeschläfert. Nach der letzten Bildgebungssitzung wird die Maus durch Kohlendioxid-Erstickung eingeschläfert, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation.
HINWEIS: Beispiele für frühe Euthanasiekriterien sind unter anderem ein signifikanter Gewichtsverlust (>20%), neurologische Störungen, Dyspnoe, übermäßige Blutungen während der Operation oder ausgeprägtes stereotypes Verhalten. Untersuchen Sie das Schädelfenster und reinigen Sie es bei Bedarf mit Kochsalzlösung oder Alkohol. - Um das Tumorwachstum zu verfolgen und die Bildgebungszeitpunkte zu planen, führen Sie eine Ganzkörper-Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) durch. Injizieren Sie dazu 150 mg/kg D-Luciferin intraperitoneal und bilden Sie das Tier nach 5-15 min ab.
- Überwachen Sie das Tier nach der Genesung täglich auf Anzeichen von Schmerzen, Stress oder Infektionen. Verabreichen Sie bei Bedarf Analgetika, entzündungshemmende Medikamente oder Antibiotika. Wenn ein Tier den Endpunkt der Studie erreicht, wird es auf humane Weise eingeschläfert. Nach der letzten Bildgebungssitzung wird die Maus durch Kohlendioxid-Erstickung eingeschläfert, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation.
4. Synthese von Nanopartikeln
- Partikel-Aufbereitung
- Fügen Sie 11,17 ml Ferumoxytol (insgesamt 6 mmol Fe) zu einer Lösung hinzu, die 50 ml 5 M NaOH, 20 ml deionisiertes Wasser (DI-Wasser) und 20 ml Epichlorhydrin enthält. Beobachten Sie in diesem Stadium die Phasentrennung. Inkubieren Sie die Mischung bei RT unter leichtem Schütteln für 24 Stunden.
- Nach 24 h wird die Lösung gleichmäßig. Entfernen Sie überschüssiges Epichlorhydrin 3 Tage lang mit einem Dialyseschlauch (12.000-14.000 Da Cutoff) gegen Wasser.
- Nach der Dialyse die im Röhrchen verbleibende Lösung in eine Glasflasche (Gesamtvolumen ~110 ml) umfüllen. Fügen Sie 30 ml Ammoniakhydroxid hinzu und rühren Sie die Mischung bei 37 °C 18-20 h lang.
- Wiederholen Sie nach dem Rühren die Dialyse gegen Wasser für 3 Tage. Füllen Sie die im Dialyseschlauch verbleibende Lösung in eine neue Glasflasche mit einem Gesamtvolumen von ~110 ml.
- Fluorescein-Isothiocyanat-Konjugation (FITC)
- Nehmen Sie 27,5 ml aminfunktionalisierte Partikel für die FITC-Konjugation heraus. Konzentrieren Sie die Partikel mit einem 10 kDa Ultrazentrifugationsfilter und waschen Sie sie mit einem pH 9 (Na2CO3 / NaHCO3) Puffer bei 5752 x g bei 25 °C für 10 min.
- Geben Sie 4 ml der Lösung in den Filter und zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 5752 x g bei 25 °C für 10 min. Entsorgen Sie das Filtrat und füllen Sie den Filter wieder mit Puffer für eine zweite Waschrunde mit dem gleichen Protokoll.
- Das Filtrat verwerfen und die Lösung mit einer Pipette im Filter auffangen. Schätzen Sie die molare Konzentration des Partikels anhand der Massenkonzentration von Ferumoxytol, wobei der Durchmesser jedes Partikels 5 nm beträgt.
- FITC in wasserfreiem Dimethylsulfoxid (DMSO) bei 10 mg/ml auflösen. Geben Sie langsam 1,4 ml DMSO-gelöstes FITC in das konzentrierte Amin-funktionalisierte Partikel. Das molare Verhältnis von FITC: Partikel beträgt 20:1. Danach die Lösung bei 4 °C 8 h im Dunkeln inkubieren.
- Die Reaktion wird durch Zugabe von überschüssigem NH3 gestillt. H2O (die Endkonzentration von NH3. H2O ist 50 mM) und lässt die Lösung dann 2 h lang bei 4 °C im Dunkeln stehen. Überschüssiges FITC mit Na2CO3/NaHCO3 (pH 9) Puffer durch einen 10 kDa Filter bei 5752 x g bei 25 °C für 10 min abwaschen. Der endgültige pH-Wert der Lösung wird mit wässriger HCl-Lösung auf 7,4 eingestellt.
5. 2P-IVM
HINWEIS: Für die 2P-IVM-Sitzungen wurde ein Prairie Ultima IV-Mikroskop mit einem benutzerdefinierten Tisch (Abbildung 2 und ergänzende Kodierungsdatei 1) verwendet, mit dem die Position des Schädelfensters horizontal und vertikal eingestellt werden kann. Für die Nachbearbeitung und Bildanalyse wurde eine Fiji-Software verwendet. Auf diese Weise kann der Laserstrahl so eingestellt werden, dass er in einem Winkel von 90 ° auf das Glas trifft, Artefakte reduziert und die Bildqualität verbessert.
- Bildgebende Sitzung
- Schalten Sie den Ti-Sapphire-Laser ein. Schalten Sie den Hauptsystem-Switch und die Prairie View-Software ein.
- Betäuben Sie das Tier, wie oben beschrieben (Schritt 2.2). Führen Sie Bildgebungssitzungen für bis zu 2 Stunden pro Tier durch. Beschränken Sie die Bildgebungszeit auf ein Minimum, um das Risiko von Anästhesiekomplikationen und der damit verbundenen Morbidität oder Mortalität zu verringern.
- Immobilisieren Sie die Maus unter dem Zwei-Photonen-Mikroskop mit einem benutzerdefinierten Tisch (Abbildung 1B, rechte Spalte). Legen Sie das Tier in Bauchlage auf ein Heizkissen, das für Nagetieroperationen entwickelt wurde, und befestigen Sie es leicht mit Klebeband, wobei Sie darauf achten, den Brustkorb nicht einzuengen. Geben Sie einen Tropfen Wasser auf das Schädelfenster und stellen Sie den Fokus ein.
- Erfassen Sie die Herzfrequenz und die Sauerstoffversorgung des Blutes, um die Vitalparameter der Tiere zu überwachen. Positionieren Sie den Sensor an der Hinterpfote und halten Sie das Überwachungsgerät außerhalb der Zwei-Photonen-Bildgebungskammer.
- Sobald sich das Tier auf dem Mikroskoptisch befindet, passen Sie die Kopfposition an. Stellen Sie mit dem Fernglas und der Weitfeld-Fluoreszenzbeleuchtung den RFP-Filter (Red Fluorescent Protein) ein und suchen Sie das gewünschte Bildfeld (Abbildung 1B, rechte Spalte).
- Sobald die Probenorientierung und das Sichtfeld bestimmt sind, schalten Sie das Mikroskop vom Weitfeldmodus in den Lichtscanning-Mikroskopie-Modus (LSM) um.
- Stellen Sie sicher, dass der Ti-Saphir-Laser bei 920 nm modengekoppelt ist und alle Verschlüsse geöffnet sind. Bringen Sie die Spannungen der GaAsP-Photomultiplier-Röhrendetektoren (PMT) auf 500-600 V. Verwenden Sie zwei PMTs mit Filtersätzen mit Bandpässen bei 595/50 (RFP) und 525/50.
- Drücken Sie Live-Bild und modifizieren Sie die Pockel-Zelle langsam, um die Laserleistung an der Probe zu erhöhen, bis ein Bild sichtbar ist.
- Sobald ein klares Bild erreicht ist, verwenden Sie die Software und den motorisierten Tisch, um die Ober- und Unterseite eines Bildstapels innerhalb des gewünschten Probenbereichs einzustellen. Achten Sie auf die Schrittweite und berücksichtigen Sie, dass die Z-Achse die Tiefe des Objektivs einstellt.
- Mit zunehmender Tiefe werden die Bilder dunkler. Erhöhen Sie die Pockels/PMT-Verstärkung langsam, um das Bild hell zu halten. Achten Sie darauf, nicht zu viel Strom zu verbrauchen, da dies zu Phototoxizität und Gewebeschäden führen kann.
- Legen Sie einen Speicherpfad fest und starten Sie die Z-Serie. Es fährt automatisch zur Start- und Endposition mit den eingestellten Pockel/PMT-Einstellungen. Sobald der Stapel fertig ist, verwenden Sie die Wiedergabe, um den Stapel auf Qualität zu überprüfen. Sobald die Aufnahme der erforderlichen Bilder abgeschlossen ist, schalten Sie den Ti-Sapphire-Laser aus.
- Bringen Sie das Tier wie oben beschrieben in einen Auffangkäfig (Schritt 3.1).
- Beenden Sie die Prairie-Ansicht und stellen Sie sicher, dass alle Daten gespeichert/übertragen wurden. Fahren Sie den Computer herunter und fahren Sie die gesamte Hardware herunter.
- Nachbearbeitung mit FIJI
HINWEIS: Fiji ist eine Open-Source-Software, die sich auf die biologische Bildanalysekonzentriert 21.- Laden Sie FIJI in Bezug auf das Betriebssystem herunter. Entpacken Sie den Ordnerinhalt und führen Sie die .exe Datei aus.
- Ziehen Sie die .env-Datei, die aus dem Zwei-Photonen-Imaging gesammelt wurde, in das Dialogfeld. Teilen Sie die Kanäle in verschiedene Bildrahmen auf. Dadurch werden zwei verschiedene Bilder mit unterschiedlichen Kanälen erstellt, von denen eines das Zellsignal und das andere das Teilchensignal enthält.
- Kopieren Sie eines der Bilder und klicken Sie auf Datei > Neu > Interne Zwischenablage , um ein weiteres Bild zu erstellen. Benennen Sie eines der Bilder in Quelle und das andere in Kopie um.
- Verwenden Sie das Kopierbild und klicken Sie im Dialogfeld auf Verarbeiten > Kontrast verbessern . Klicken Sie auf Normalisieren und OK und dann auf > Glätten verarbeiten. Dieses Bild wird zum Erstellen einer Maske und nicht zur Analyse verwendet. Klicken Sie im Dialogfeld auf Bild> > Schwellenwert anpassen . Verwenden Sie die Gleitskala und die Methode, die zum Extrahieren geeignet ist, und klicken Sie dann auf Anwenden.
- Verwenden Sie "Prozess > Binär > Erodieren ", um einzelne Pixel im Hintergrund zu erodieren, und klicken Sie auf "Verarbeiten> Binär > "Dilatieren ", um dem Bild wieder Pixel hinzuzufügen.
- Klicken Sie im Dialogfeld auf Process > Image Calculator , wählen Sie das Quellbild als erstes und das zweite Bild als Kopie aus. Verwenden Sie UND , um die Schnittmenge beider Bilder zu erstellen. Wiederholen Sie den gleichen Schritt für das Bild des anderen Kanals.
- Öffnen Sie für die Signalanalyse außerhalb der Gefäßregion ein unverändertes kopiertes Bild und löschen Sie den Gefäßbereich des Signals mit dem Freehand-ROI-Tool.
- Stellen Sie die gewünschten Parameter ein, indem Sie zu Analysieren > Messungen einstellen gehen. Stellen Sie sicher , dass Fläche, Integrierte Dichte und Mittlerer Grauwert aktiviert sind.
- Analysieren Sie nun mit Analysieren > Messen. Es öffnet sich ein Fenster mit den Messungen. Kopieren Sie die Daten in eine Tabelle.
- Wählen Sie nun einen kleinen Bereich des Bildes aus, der keine Fluoreszenz aufweist. Dies wird der Hintergrund sein.
- Klicken Sie für diese Region auf Analysieren > Messen . Kopieren Sie Daten in eine Tabelle.
- Speichern Sie das resultierende Bild als Datei > Dateityp > Analysieren Sie es für Neumessungen oder Veröffentlichungszwecke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier führten wir eine kraniale Fensteroperation durch und transplantierten C6-Zellen in einem NSG-Mausmodell von GBM (n = 5). Eine ordnungsgemäße Abdichtung zwischen allen an der Herstellung des Fensters beteiligten Komponenten (Abbildung 1A) gewährleistet die Haltbarkeit der Fenster für die Langzeitbildgebung und reduziert zusätzlich die Morbidität. Mit dem für in vivo 2P-IVM angepassten Tisch (Abbildung 2) konnten wir Tiere unter Narkose bis zu 2 Stunden lang ohne größere Bewegungsartefakte abbilden. Etwa 10 Minuten nach intravenöser Applikation der Nanopartikel bei GBM-tragenden Mäusen zeigt 2P-IVM das grüne, fluoreszierende Signal von Gefäßen in der Region des Tumors, das mit der intravaskulären Lokalisation der FITC-markierten Nanopartikel übereinstimmt. Außerhalb der Blutgefäße wird nur eine geringe Menge an grün fluoreszierendem Signal festgestellt, was auf die beginnende Extravasation von NPs hinweist (Abbildung 3A). Es ist ein Anstieg des FITC-Signals aus dem extravaskulären Raum zu beobachten, was mit einer fortgeschrittenen Extravasation übereinstimmt (Abbildung 3B).
Abbildung 1. Platzierung des Schädelfensters, Kraniotomie, Implantation und Bildgebung. (A) Querschnitt der anatomischen Platzierung eines Schädelfensters. Da der Kopfbügel metallfrei ist, ist es möglich, neben der Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie auch eine Magnetresonanztomographie oder eine Magnetpartikelbildgebung durchzuführen. (B) Übersicht (obere Reihe) und Detailansicht (untere Reihe) der Kraniotomie (links), der Zellimplantation (Mitte) und der 2-Photonen-Intravitalmikroskopie (rechts). Beim Öffnen des Schädels kommt es zu oberflächlichen Blutungen (links) und wird schnell resorbiert (Mitte). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Computergestützte Konstruktion (CAD) der Bühne. CAD des Tisches, der für die In-vivo-2-Photonen-Intravitalmikroskopie verwendet wird, einschließlich einer Beißstange, Kopfstangenstabilisierung und Schrauben für Höhen- und Winkeleinstellungen. Die 3D-CAD-Datei finden Sie in der ergänzenden Codierungsdatei 1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. In-vivo-2-Photonen-Intravitalmikroskopie-Aufnahmen. Bilder, die (A) 10 min und (B) 24 h nach intravenöser Verabreichung von Nanopartikeln aufgenommen wurden. Während die GBM-Zellen Fluoreszenzsignale im roten Spektrum (links) aussenden, sind die Nanopartikel im Hirngewebe grün (rechts) visualisiert. # zeigt extravasierte NPs an, * zeigt ein Blutgefäß an. Nur eine begrenzte Anzahl von Partikeln wurde extravasiert und ist 10 Minuten nach der NP-Verabreichung in der Nähe der Tumorzellen sichtbar. Im Bereich der GBM-Zellen ist eine Fülle von Partikeln sichtbar, was auf eine Extravasation 24 Stunden nach der NP-Verabreichung hindeutet. Die Nanopartikel bestehen aus Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) und Eisenoxid-Nanopartikeln (Ferumoxytol). Die Maßstabsbalken stehen für 100 μm. Abkürzungen: 2P-IVM: 2-Photonen-Intravitalmikroskopie, RFP: rot fluoreszierendes Protein, GBM: Glioblastom, FITC: Fluoresceinisothiocyanat, NP: Nanopartikel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Codierungsdatei 1: 3D-CAD-Datei der Bühne. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wir präsentieren eine Methode zur Echtzeit-In-vivo-NP-Verfolgung mit 2P-IVM durch ein kraniales Fenster, um die Tumorabgabe von fluoreszenzmarkierten Eisenoxid-NPs zu bewerten. Die Operationstechnik für diesen Eingriff erfordert eine ruhige Hand und fortgeschrittene experimentelle chirurgische Fähigkeiten. Es ist ratsam, den Umgang mit Kadavern oder Phantomen zu üben, bevor Sie zur Live-Tiererfahrung übergehen. Als Alternative implementierten Hoeferlin et al. einen Roboterbohrer, um thermische Schäden zu reduzieren, die Variabilität der Operationstechnik zu minimieren und die Chirurgie zu standardisieren22.
Die Größe des Fensters stellt einen weiteren kritischen Parameter dar. Ein größeres Fenster würde die Bildgebung eines größeren Teils des Tumors mit 2P-IVM ermöglichen. In der Literatur wurden Größen zwischen 3 und 7 mm beschrieben23. Größere Fenster können jedoch die Gehirnverkrümmung nicht aufnehmen, was zu einem erhöhten regionalen Druck führen kann24. Um diese Einschränkung zu überwinden, kann stattdessen ein sogenannter "Glasschädel" verwendet werden25. Im Vergleich zu herkömmlichen Glasfenstern wird bei dieser Methode gebogenes Glas verwendet, das die Krümmung des Gehirns ausgleicht und so die Schaffung größerer Fenster ermöglicht, während der Fokusdruck auf den Kortex reduziert wird. Diese Art von gebogenem Glas ist nicht im Handel erhältlich und hat nur begrenzte Anwendungen in 2P-IVM, da die gekrümmte Oberfläche Reflexionsartefakte verursacht, die den Bereich des Fensters begrenzen, der abgebildet werden kann. Eine weitere Alternative ist ein siliziumbasiertes Fenster24. Einerseits bietet diese Methode mehr Flexibilität in Bezug auf die Größe und Form des zu erstellenden Fensters. Darüber hinaus wurden vergleichbare Ergebnisse in Bezug auf Fensterversagen und Entzündungsraten wie bei klassischen Glasfenstern berichtet. Andererseits hat sich gezeigt, dass die 2-Photonen-Abbildungsqualität in polymerbasierten Fenstern schneller abnimmt als in Glasfenstern, was sie für Langzeitanwendungen nicht praktikabel macht26. Ein ausgedünntes Schädelschädelfenster stellt eine weitere Alternative dar. Obwohl es weniger invasiv ist als das klassische Glasfenster, ermöglicht es keine GBM-Zellimplantation mit der gleichen Technik wie hier beschrieben. Darüber hinaus ist es schwierig, eine konsistente Schädeldicke zu erreichen, was zu erheblichen Artefakten in 2P-IVM27 führen kann.
Die Zelllinie und die Menge der implantierten GBM-Zellen sind weitere wichtige Überlegungen bei der Planung des Studienzeitplans. Die C6-Rattengliom-Zelllinie ist eine der am weitesten verbreiteten Zelllinien in der GBM-Forschung. Bei Ratten und Mäusen wurden Zellzahlen zwischen 5 x 104 und 5 x 106 für intrakranielle Implantationen berichtet 27,28,29,30,31. In der Regel ist bei der Implantation einer höheren Anzahl von Zellen mit einem schnelleren Tumorwachstum zu rechnen. In diesem Protokoll wurden 1 x 105 Zellen implantiert und die Bildgebung wurde an den Tagen 11 und 12 nach der Implantation durchgeführt. Xin et al. implantierten 1 x 105 C6-Zellen in BALB/c-Nacktmäusen und berichteten über den Nachweis eines fortgeschrittenen GBM im MRT am Tag 7 nach der Implantation und eine erhöhte Mortalität nach 15 Tagen30. Im Vergleich dazu verwendeten Jia et al. eine höhere Anzahl von Zellen (1 x 106) und den gleichen Mausstamm und detektierten am Tag 7 im MRT eine kleine Tumormasse mit einer leicht gestörten Blut-Hirn-Schranke (BHS), wie eine blasse Evans-Blau-Färbung im GBM-Gewebe zeigte32. An Tag 14 war die Evans-Blaufärbung stärker als an Tag 7, was darauf hindeutet, dass die BHS stark gestört war. Das Tumorwachstum wirkt sich wiederum auch darauf aus, wie lange die Tiere im Versuch gehalten werden können. Dies ist ein wichtiger Aspekt des Tierschutzes für Längsschnitt-Bildgebungsstudien. Es wurde berichtet, dass chronische Schädelfenster bis zu 6 Monate nach der Implantation für die Bildgebung geeignet sind26.
Die in diesem Protokoll verwendeten Nanopartikel bestehen aus Eisenoxid- und Fluorophorkomponenten. Mögliche Anwendungen sind die Untersuchung der Tumorabgabe neuartiger therapeutischer Medikamente, zellulärer Therapeutika und Eingriffe in das Tumorgefäßsystem und die Tumormikroumgebung. Verschiedene Wirkstoffkandidaten und Kombinationstherapien können auf zellulärer und molekularer Ebene evaluiert werden. Die Eisenoxidkomponente der NPs ermöglicht zusätzlich zu 2P-IVM eine multimodale Bildgebung mit MRT oder Magnetpartikelbildgebung. Während die MRT eine klinisch relevante Bildgebungsmodalität darstellt, ist ihre anatomische Auflösung der der Intravitalmikroskopieunterlegen 33.
Auch diese Methode hat gewisse Einschränkungen. Die Gehirnkoordinaten nach einem Mäusehirnatlas sind für C57BL/6J-Mäuse standardisiert und müssen je nach Mausstamm, Geschlecht und Alter angepasst werden. Darüber hinaus kann mit der Zwei-Photonen-Bildgebung nur eine begrenzte Tiefe von ca. 450 μm erreicht werden9. Daher ist mit 2P-IVM nur eine partielle Charakterisierung des Tumors möglich, und regionale Unterschiede in den Tumoreigenschaften konnten übersehen werden. Darüber hinaus wurden nur zwei Zeitpunkte nach der NP-Verabreichung berücksichtigt. Zukünftige Studien, einschließlich weiterer Zeitpunkte nach intravenöser Verabreichung, werden eine detailliertere Analyse des raumzeitlichen Verhaltens der NPs in der Tumormikroumgebung ermöglichen.
Abschließend untersuchten wir die Tumorabgabe von fluoreszenzmarkierten Eisenoxid-Nanopartikeln mit 2P-IVM in einem Mausmodell von GBM. Diese Methode kann leicht an verschiedene Forschungsbereiche angepasst werden und stellt ein wichtiges Werkzeug für die In-vivo-Bildgebung des Gehirns im Bereich der Neurowissenschaften dar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.
Acknowledgments
Wir danken dem Stanford Wu Tsai Neuroscience Microscopy Service, dem Stanford Center for Innovations in In Vivo Imaging (SCi3) - Small Animal Imaging Center, dem NIH S10 Shared Instrumentation Grant (S10RR026917-01, PI Michael Moseley, Ph.D.) und der Stanford Preclinical Imaging Facility am Porter Drive für die Bereitstellung der Ausrüstung und Infrastruktur für dieses Projekt. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss des National Institute for Child Health and Human Development, Fördernummer R01HD103638, unterstützt. Wir bedanken uns bei der Schnitzer Group, Stanford University; das Zuo-Labor, Universität von Santa Cruz; und das Neurovascular Imaging Laboratory, Boston Photonic Center, University of Boston, für pädagogische Diskussionen über Zwei-Photonen-Bildgebung und kraniale Fenstermodelle.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride infusion solution | Baxter Corp | 533-JB1301P | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium |
Invitrogen | 11965-092 | |
| 1 mL syringes | BD | Luer-Lok syringe, REF309628 | |
| 10% FBS | Thermo fisher | Cytiva SH30910.03HI | |
| 10% DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| 2-photon microscope | Prairie Technologies, Bruker | Prairie Ultima IV | |
| Alcohol applicators, 70% | Medline Industries, LP | MDS093810 | |
| Alcohol, spray bottle | Decon Labs Inc | Decon SaniHol, 04-355-122 | |
| Aluminum foil | Reynold Brands | Reynold Wrap non-stick aluminum foil | |
| Anesthesia machine | Patterson Scientific | SAS3 | |
| Anesthesia monitoring | Kent Scientific | MouseSTAT Jr. Rodent Pulsoxymeter | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x), liquid | Invitrogen | 15240-096 | |
| Betadine applicators | Professional Disposables International, Inc | S41125 | |
| Biopsy punch, 5 mm | Miltex | Size 5 | |
| Buprenorphine sustained release | Zoo Pharm | Bup SR Lab, 1.0 mg/mL | A generic drug can be used instead. |
| C6 rat glioma cell line | ATCC (American Tissue Culture Collection) | CCL-107 | |
| Cannulas | BD | 16 G, 1.1/2”, 30 G, 1” | |
| Carprofen | Pfizer | Rimadyl, 50 mg/ml | A generic drug can be used instead. |
| Cefazoline | Sagent Pharmaceuticals | 25021-101-10, 1 g/vial | A generic drug can be used instead. |
| Cell strainer, 40 µm | Fisher Scientific | 87711 | |
| Cotton tip applicators, 6” | Dyad Medical Sourcing, LLC | HCS1005 | |
| Dental cement | Stoelting Co | 51459 | Dental cement kit, clear, 2 components |
| Dexamethasone | Bimeda | 138RX, 2 mg/mL | A generic drug can be used instead. |
| DietGel | ClearH2O | Recovery, 72-06-502 | |
| Drape | Cardinal Health | Bio Shield Wrap | |
| Drill | Saeyang Microtech | Escort Pro, B08350 | |
| Drill tips | Hager & Meissinger GmbH | REF310104001001005 | Size 005, US 1/4 |
| FIJI imaging analysis software | National Institute of Health | https://imagej.net/software/fiji/ | |
| Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | |
| Gauze | Fisher HealthCare | Sterile Cotton Gauze Pad, 4 x 4”, 22-415-469 | |
| Gelfoam | Ethicon Inc. | Surgifoam absorbable gelatin sponge, Ref. 1972 | |
| Germinator | Cellpoint Scientific | Germinator 500, No. 11688 | |
| Glass coverslips, 5 mm diameter | Fisher Scientific | Menzel Cover glass | |
| Gloves, non-sterile | Fisher Scientific | Nitrile powder-free medical examination gloves | |
| Gloves, sterile | Medline Industries, LP | MDS104070 | |
| Hair removal cream | Church & Dwight | Nair Hair remover lotion | |
| Hamilton syringe | Hamilton Company Inc | Gastight #1701, 10 µL | |
| HBSS without Ca, Mg | Fisher Scientific | PI88284 | |
| Head bar | Hongway | 5 mm inner diameter O-rings | |
| Heating pad | Stoelting Co. | Rodent warmer X2 | |
| Insulin syringes | Exel International Medical Products | 29G x 1/2″ | |
| Iron oxide nanoparticles | Covis Pharma GmbH | Feraheme ferumoxytol injection, 510 mg/17 mL, 59338077501 | |
| Isoflurane | Dechra | 26675-46-7 | |
| Mice | Jackson Laboratories | NSG, Strain 005557 | |
| Microscope (surgery) | Seiler Medical | Seiler IQ Q-100-220 | |
| Nanoparticles | Custom | Iron oxide nanoparticles (Ferumoxytol) labeled with fluorescein isothiocyanate | |
| Ophtalmic ointment | Major pharmaceuticals | Lubrifresh P.M. nighttime ointment, 203964 | |
| Oxygen | Linde Gas & Equipment Inc. | High Pressure Steel K Style Cylinder, 249CF, 2000PSIG, CGA 540 | |
| Plastic cups | Georgia-Pacirif Consumer Products | Dixie Portion Cup, 2 oz., Plastic, Clear, PK2400 | |
| Polyethylene tubing | Braintree Scientific | 50-195-5494 | |
| Scale | Ohaus Corp | CR2200 | |
| Scalpel | Integra Life Sciences Production Corp | Integra Miltex Stainless steel disposable scalpel | |
| Scissors | Fisher Scientific | 13-804-18 | |
| Sealant | Henkel Corp | Loctite 4014 | |
| Single use lab gown | High Tech Conversions | 17-444-081 | |
| Stereotactic frame | Stoelting Co. | Stoelting New Standard TM | |
| Sterile Vacuum Bottle Top Filtration Systems | Fisher Scientific | S2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE | |
| Styrofoam box | N/A | N/A | |
| Surgical gloves | Cardinal Health | 19-163-108 | |
| Surgical glue, 3M Vetbond tissues adhesive | 3M Animal Care Prodcuts | 1469SB | |
| Tail vein cathether | Custom | Consists of two 30 G cannulas connected with sillicone tubing | |
| TrypLE Express (1x), no phenol red | Invitrogen | 12604-039 | |
| Ultraviolett torch | Spring sunshine technology | Consciot |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Wang, Z., McCracken, S., Williams, P. R. Transpupillary two-photon in vivo imaging of the mouse retina. J Vis Exp. 168, 61970 (2021).
- Zhang, K., et al. In vivo two-photon microscopy reveals the contribution of Sox9+ to kidney regeneration in a mouse model with extracellular vesicle treatment. J Biol Chem. 295 (34), 12203 (2020).
- Jang, W. H., et al. Two-photon microscopy of Paneth cells in the small intestine of live mice. Sci Rep. 8 (1), 14174 (2018).
- Ihler, F., Bertlich, M., Weiss, B., Dietzel, S., Canis, M. Two-photon microscopy allows imaging and characterization of cochlear microvasculature in vivo. Biomed Res Int. 2015, 154272 (2015).
- Matsuura, R., et al. Intravital imaging with two-photon microscopy reveals cellular dynamics in the ischeamia-reperfused rat heart. Sci Rep. 8 (1), 15991 (2018).
- Veres, T. Z., et al. Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy. Sci Rep. 7 (1), 694 (2017).
- Zong, W., et al. Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice. Cell. 185 (7), 1240-1256.e30 (2022).
- Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain. eNeuro. 17 (1), (2019).
- Birkner, A., Konnerth, A. Deep two-photon imaging in vivo with a red-shifted calcium indicator. Methods Mol Biol. 1929, 15-26 (1929).
- Busche, M. A. In vivo two-photon calcium imaging of hippocampal neurons in Alzheimer mouse models. Methods Mol Biol. 1750, 341-351 (2018).
- Li, L., et al. A sensitive two-photon probe to selectively detect monoamine oxidase B activity in Parkinson's disease models. Nat Commun. 5, 3276 (2014).
- Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (3), (2013).
- Ricard, C., et al. Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice. Sci Rep. 6, 26381 (2016).
- Soubéran, A., et al. Effects of VEGF blockade on the dynamics of the inflammatory landscape in glioblastoma-bearing mice. J Neuroinflammation. 16 (1), 191 (2019).
- Zhang, W., et al. Real-time vivo reveals specific nanoparticle target binding in a syngeneic glioma mouse model. Nanoscale. 14 (15), 5678-5688 (2022).
- Wartchow, K. M., et al. Treatment with cyclic AMP activators reduces glioblastoma growth and invasion as assessed by two-photon microscopy. Cells. 10 (3), 556 (2021).
- Jiang, L. W., et al. Label-free detection of fibrillar collagen deposition associated with vascular elements in glioblastoma multiforme by using multiphoton microscopy. J Microsc. 265 (2), 207-213 (2017).
- Chen, Z., Ross, J. L., Hambardzumyan, D. Intravital 2-photon imaging reveals distinct morphology and infiltrative properties of glioblastoma-associated macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (28), 14254-14259 (2019).
- Zhang, Y. S., et al. Labeling human mesenchymal stem cells with gold nanocages for in vitro and in vivo tracking by two-photon microscopy and photoacoustic microscopy. Theranostics. 3 (8), 532-543 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hoeferlin, G. F., Menendez, D. M., Krebs, O. K., Capadona, J. R., Shoffstall, A. J. Assessment of thermal damage from robot-drilled craniotomy for cranial window surgery in mice. J Vis Exp. 189, 64188 (2022).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Sci Rep. 6, 27818 (2016).
- Kim, T. H., et al. Long-term optical access to an estimated one million neurons in the live mouse cortex. Cell Rep. 17 (12), 3385-3394 (2016).
- Kılıç, K., et al. Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice. Front Physiol. 11, 612678 (2021).
- Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. Analysis of optical properties of the mouse cranium-implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 178 (2), 316-322 (2009).
- Lu, W., Sun, Q., Wan, J., She, Z., Jiang, X. G. Cationic albumin-conjugated pegylated nanoparticles allow gene delivery into brain tumors via intravenous administration. Cancer Res. 66 (24), 11878-11887 (2006).
- Zhang, B., et al. LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma. Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).
- Xin, H., et al. Enhanced anti-glioblastoma efficacy by PTX-loaded PEGylated poly(ɛ-caprolactone) nanoparticles: In vitro and in vivo evaluation. Int J Pharm. 402 (1-2), 238-247 (2010).
- Valable, S., et al. In vivo MRI tracking of exogenous monocytes/macrophages targeting brain tumors in a rat model of glioma. Neuroimage. 40 (2), 972 (2008).
- Jia, Y., et al. Phototheranostics: Active targeting of orthotopic glioma using biomimetic proteolipid nanoparticles. ACS Nano. 13 (1), 386-398 (2021).
- Asan, L., et al. Cellular correlates of gray matter volume changes in magnetic resonance morphometry identified by two-photon microscopy. Sci Rep. 11, 4234 (2021).
