Summary
Bir fare modelinde floresan etiketli demir oksit nanopartiküllerinin glioblastoma tümör iletiminin iki foton mikroskobu için yeni bir yaklaşım sunuyoruz.
Abstract
İntravenöz olarak uygulanan kanser terapötiklerinin beyin tümörlerine verilmesi, kan-beyin bariyeri ile sınırlıdır. Beyin tümörlerinde makromoleküllerin birikimini ve dağılımını in vivo olarak doğrudan görüntülemek için bir yöntem, klinik öncesi modellerde ilaç dağıtımını anlama ve optimize etme yeteneğimizi büyük ölçüde artıracaktır. Bu protokol, bir fare glioblastoma (GBM) modelinde iki fotonlu intravital mikroskopi (2P-IVM) ile intravenöz olarak uygulanan floresan etiketli nanopartiküllerin gerçek zamanlı in vivo takibi için bir yöntemi açıklar.
Protokol, deney hayvanlarının anestezi ve analjezisi, bir kraniyal pencere oluşturma, GBM hücre implantasyonu, bir kafa çubuğu yerleştirme, 2P-IVM çalışmaları yürütme ve uzun süreli takip çalışmaları için cerrahi sonrası bakım dahil olmak üzere prosedürün çok aşamalı bir tanımını içerir. Temsili 2P-IVM görüntüleme seansları ve görüntü analizi gösteriyoruz, bu teknolojinin avantaj ve dezavantajlarını inceliyoruz ve potansiyel uygulamaları tartışıyoruz.
Bu yöntem, in vivo preklinik beyin görüntüleme alanındaki farklı araştırma soruları için kolayca değiştirilebilir ve uyarlanabilir.
Introduction
İki fotonlu intravital mikroskopi (2P-IVM), canlı doku1'in görüntülenmesini sağlayan bir floresan görüntüleme tekniğidir.
İlk olarak 1990'larda geliştirilen 2P-IVM, çeşitli klinik öncesi modellerde retina2, böbrek3, ince bağırsak4, koklea5, kalp6, trakea7 ve beynin in vivo analizi için kullanılmıştır 8,9. Sinirbilim alanında, 2P-IVM, uyanık hayvanlarda sağlıklı beynin gerçek zamanlı görüntülenmesi için bir teknik olarakönem kazanmıştır 10 ve Alzheimer11, Parkinson12 ve glioblastoma (GBM) gibi sinir sistemi hastalıklarını incelemenin yanı sıra13,14,15,16.
2P-IVM, GBM'nin gelişimi sırasında tümör mikroçevresini incelemek için zarif bir çözüm sunar. Daha önceki bazı çalışmalar in vitro17 ve ex vivo modeller18'e odaklanırken, diğerleri GBM'yi incelemek için ortotopik19 ve ksenotropik20 in vivo modelleri uyguladı. Madden ve ark. bir fare modelinde CNS-1 sıçan glioma hücre hattının doğal görüntülemesini gerçekleştirdi13. Ortotopik bir GL261-DsRed murin modeli kullanarak, Ricard ve ark. 2P-IVM14'te tümör bölgesindeki kan damarlarını geliştirmek için intravenöz bir florofor uygulaması gerçekleştirdi.
Burada, GBM'nin ortotopik bir fare modelinde floresan etiketli demir oksit nanopartiküllerinin (NP) tümör iletimini izlemek için 2P-IVM uyguluyoruz. Bir kraniyal pencere kullanarak, bu yöntem beyindeki NP'lerin gerçek zamanlı uzay-zamansal dağılımını ayrıntılı olarak incelememizi sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde açıklanan hayvan prosedürü, Laboratuvar Hayvanları Bakımı İdari Paneli'nin (APLAC) gerekliliklerine uygundur.
1. Hücre kültürü
- Davlumbazın hazırlanması
- Ellerinizi yıkayın, eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin. Biyolojik güvenlik kabinini açın ve kanat seviyesini uygun bir açılma yüksekliğine ayarlayın. Davlumbazın 3-5 dakika kurumasına izin verin. Davlumbaz bölgesine %70 etanol püskürtün ve kağıt mendille silin.
- Tüm reaktifleri% 70 etanol ile püskürtün ve kağıt mendille silin. Reaktifleri kaputun içine taşıyın. Izgaraya herhangi bir eşya koymayın. Davlumbazda bir dökülme meydana gelirse, mendille örtün,% 70 etanol püskürtün ve tekrar silin.
- Deneyden sonra, her bir öğenin kapaklarını dikkatlice kapatın, tüm malzemeleri silin, tüm öğeleri başlıktan çıkarın ve orijinal konumlarına aktarın. Davlumbaza% 70 etanol püskürtün ve silin. Kanadı kapatın ve biyolojik güvenlik kabinini kapatın.
- Bir büyüme ortamının hazırlanması
- 500 mL Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'una (DMEM) 50 mL% 100 fetal sığır serumu (FBS) ekleyin. 5 mL antibiyotik-antimikotik solüsyon (100x) ekleyin.
- Tüm reaktifleri steril bir 500 mL filtreleme şişesinden (0.22 μm filtre) geçirin.
- Dondurularak saklanmış hücrelerin çözülmesi
- Bir laminer akış başlığında, bir T75 şişesine 20 mL büyüme ortamı ekleyin. Şişeyi, şişedeki hücrelerin adı, tarih ve geçiş numarası ile etiketleyin. Bu çalışmada yapışık C6 glioma hücreleri kullanıldı.
- Hücreleri 37 °C'lik bir su banyosunda hızla çözdürün. Hücreleri girdaplamayın. Hücreleri çözün ve hemen kullanın.
- Çözülmüş hücreleri 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak T75 şişesine aktarın. Transfer işlemi sırasında herhangi bir kabarcık oluşturmamaya dikkat edin ve şişenin boynunda herhangi bir orta kalıntı bırakmayın. Bu, olası kontaminasyon riskini artırabilir.
- Ortamı değiştirme
- Kalıntı tripsin veya dimetil sülfoksiti (DMSO) çıkarmak için çözülmeyi takip eden gün ortamı değiştirin (adım 1.6). Daha sonra, hücre birleşme seviyesine bağlı olarak ortamı haftada en az iki kez veya daha fazla değiştirin. Tripsini ortadan kaldırmak için ortam, geçişten bir gün sonra değiştirilmelidir.
- Ortamı değiştirmek için aspirasyon aparatını açın, aspirasyon camı pipetini takın ve tüm ortamı aspire edin.
- Büyüme ortamının 20 mL'sini ekleyin (adım 1.2).
- Hücrelerin geçirilmesi
- Kaputu deney sırasında ihtiyaç duyulan eşyalarla doldurun.
- Bir aspirasyon cam pipeti kullanın ve cam pipetin şişenin hücre olmayan tarafında olduğundan emin olarak tüm ortamı aspire edin. Bu adım için T75 şişesini dikey olarak konumlandırın.
- Hücre dışı tarafa ~ 10 mL oda sıcaklığında (RT) fosfat tamponlu salin (PBS, Ca++ ve Mg++ içermez) veya Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS, Ca++ ve Mg++ içermez) ekleyin. T75 şişesini hücre tarafı aşağı bakacak şekilde yatay olarak konumlandırarak hücreleri PBS ile kısa bir süre yıkayın.
- Şişeyi hemen dikey olarak yerleştirin ve PBS/HBSS'yi aspire edin. Bu yıkama ve aspirasyonu 3 kez tekrarlayın.
- Hücre tarafına 2 mL tripsin (rekombinant veya hayvan türevi) ekleyin (T75 şişesi yatay, hücre tarafı aşağı bakacak şekilde). Standart bir doku kültürü inkübatöründe (37 °C,% 5 CO2) 4 dakika inkübe edin. 5 mL'lik bir pipet kullanarak 2 dakika sonra bir kez ezin.
- 4 dakikalık toplam inkübasyondan sonra, çözeltiyi 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Konik tüpe 8 mL büyüme çözeltisi ekleyin (2 mL tripsinizli hücre + 8 mL ortam = toplamda 10 mL).
- Filtreli başka bir boş 15 mL konik tüp kullanın ve tek tek hücreler elde etmek için hücreleri 25 mL'lik bir pipet ile aktarın.
- Çözeltinin 1/10'unu (1 mL) (hücre + ortam + Tryp-LE) 20 mL ortam içeren bir T75 şişesine aktarın. Alternatif olarak, hücreleri sayın (adım 1.7). Tripsin olmayan bir medya çözümüne sahip olmak için ertesi gün medyayı değiştirin.
- Ortamın ve hücrelerin dondurulması
- %100 FBS'yi 4 °C buzdolabında çözdürün. FBS'deki proteinlere zarar verebileceğinden su banyosu veya ısı kullanmayın.
- 50 mL dondurma ortamı hazırlamak için 45 mL DMEM, 5 mL FBS ve 5 mL DMSO'yu karıştırın. Aralıklı çözülmeyi ve protein hasarını önlemek için 1-2 mL'lik kaplara koyun. -20 ° veya -80 °C dondurucuda saklayın.
- Kalan 9 mL çözelti için (adım 1.5), toplamda 10 mL'ye ulaşmak için 1 mL ortam ekleyin. 300 x g'da 4 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı çıkarın ve 1 mL donma ortamında yeniden süspanse edin (yukarıya bakın). Hücreleri -80 °C dondurucuda bir dondurma kabına koyun. Hücreleri 1 veya 2 gün sonra uzun süreli depolama için sıvı N2'ye taşıyın.
- Hücreleri sayma
- Kalan 9 mL için (adım 1.5), toplamda 10 mL'ye ulaşmak için 1 mL medya ekleyin. 300 x g'da 4 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı çıkarın ve 4 mL HBSS'de yeniden süspanse edin. 80 μL HBSS + 10 μL% 0.4 Tripan Mavisi içinde 10 μL hücreyi yeniden süspanse edin, seyreltme faktörü = 10.
- Çözeltiden 17 μL alın ve bir hemositometrede dört adet 4 x 4 kare sayın. Dört 4 x 4 kare için ortalama sayımlar ve hücreler/mL elde etmek için 104x seyreltme faktörü ile çarpın.
2. Ameliyat
NOT: Ameliyatın, bir kişinin hücreleri hazırlamaktan, diş çimentosunu karıştırmaktan ve genellikle prosedüre yardımcı olmaktan sorumlu olduğu, ikinci kişinin ise steril kalmaya odaklandığı iki araştırmacı tarafından yapılması önerilir. Cerrahi prosedüre yardımcı olacak ikinci bir manipülatöre sahip olmak, kontaminasyonun meydana gelme olasılığını önemli ölçüde azaltır. En iyi cerrahi uygulamaları takip etmek, ameliyat sonrası komplikasyon olasılığını azaltacaktır. Şekil 1A , kraniyal pencerenin bileşenlerine genel bir bakış sağlar.
- Genel hazırlıklar
- Başlamadan önce prosedürün yerel hayvan refahı kurum yönergeleri tarafından onaylandığını onaylayın.
NOT: Bu çalışmada 5 aylık dişi NSG fareleri (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) (n = 5). - Ameliyattan önce tüm cerrahi aletleri otoklavlayın ve gerekli tüm malzemelerin mevcut olduğundan emin olun. Anestezi ve ameliyat kayıtlarını yazdırın.
- Varışta, ameliyat sonrası ek sıkıntıyı azaltmak için hayvanların hayvan yetiştirme odasına en az 1 hafta alıştığından emin olun.
- Ameliyat günü tüm cihazların (mikroskop, ısıtma yastığı, sterilizatör, matkap, vakum vb.) kullanıma hazır olduğundan emin olunuz. Anestezi makinesinin yeterli izofluran içerdiğini onaylayın ve gerekirse yeniden doldurun. Yeni kullanıcılar için, kraniyal pencere prosedürü hayvan başına 2 saate kadar sürebilir; Bu nedenle, yeterli izoflurana sahip olmak çok önemlidir.
- Cam pencereleri ve baş çubuklarını alkole yerleştirin ve tuzlu su içeren bir kap hazırlayın. Bu, sterilitede herhangi bir büyük ihlal olmadan sorunsuz bir iş akışı sağlayacak ve her hayvan için anestezi altında geçen süreyi mümkün olduğunca kısa tutacaktır.
- Tüm cerrahi malzemeleri çalışma istasyonunda steril bir yüzeyde açın. Örneğin, steril bir gazlı bez ambalajın içi bu amaçla kullanılabilir. Yalnızca ipuçları tekniğini kullanın. Cerrahi aletler kullanılmadığında, uçları steril gazlı bez ambalajının içi gibi steril bir yüzeye yerleştirin.
- Birden fazla ameliyat gerçekleştirirken, tüm cerrahi aletleri dezenfekte etmek için ameliyatlar arasında sterilizatöre yerleştirin. 5'ten fazla hayvan üzerinde ameliyat yaparken, yeni bir otoklavlanmış alet seti kullanın. Doku travmasını önlemek için yenisi için körleştiğinde matkap ucunu değiştirin.
- Başlamadan önce prosedürün yerel hayvan refahı kurum yönergeleri tarafından onaylandığını onaylayın.
- Anestezi ve ameliyat hazırlıkları
NOT: Anestezi düzeni, görüntüleme için olduğu kadar ameliyat için de aynıdır.- Anestezik bir odada izofluran (indüksiyon için% 3 -% 5) kullanarak fareyi uyuşturun. Pedal çekme refleksini (her iki arka ayaktaki ayak yastığı sıkıştırması) test ederek yeterli anestezi derinliğini sağladıktan sonra, hayvanı bir hazırlık çalışma istasyonuna aktarın. Anesteziyi bir burun konisi üzerinde sürdürün (%1-%2). Burada, kornea hasarını önlemek için bir göz merhemi uygulayın. Ameliyat sırasında pençe refleksini kontrol ederek refleks kaybını düzenli olarak kontrol edin.
- Hayvanın herhangi bir şekilde tanımlanması gerekiyorsa, kulakları işaretlemek için bir kulak delme aleti veya makas kullanın veya kuyruğu işaretlemek için bir işaretleyici kullanın.
- Kafatasını kulaklar ve gözler arasında kaplayan kürkü tüy dökücü bir kremle çıkarın. Cilt tahrişini önlemek için kremi üretici tarafından belirtilen süre (30-60 sn) kadar bırakın. Kremi saçın çıkış yönünün tersine sürerek saç diplerine temas ettiğinden emin olun. Tüy dökücü kremin gözlerle temas etmesinden kaçının. Bölgeyi tuzlu su ile temizleyerek krem ve saç kalıntılarını temizleyin. Alternatif olarak, makas kullanın.
- Ameliyat sırasında ve sonrasında herhangi bir ağrı, enfeksiyon veya şişmeyi önlemek için steroid olmayan antienflamatuar ilaçlar (NSAID'ler), opioidler, antienflamatuar ajanlar ve antibiyotikler uygulayın. Ameliyattan önce karprofen (5-20 mg / kg, deri altı [SQ]), buprenorfin - sürekli salım (1 mg / kg SQ), sefazolin (20 mg / kg SQ) ve deksametazon (0.2 mg / kg SQ) uygulayın. Dehidrasyonu önlemek için yaklaşık 0.3 mL% 0.9 salin SQ uygulayın.
- Ardından, kafatasının ortasından çevreye dairesel hareketlerle povidon-iyot ve izopropil alkolü dönüşümlü olarak üç kez temizleyerek alanı fırçalayın.
- Kraniyotomi prosedürü
- Hayvanı ameliyat masasına aktarın ve işlem sırasında izotermal koşulları sağlamak için bir ısıtma yastığı (~ 37 ° C) üzerinde ventral yaslanma pozisyonuna yerleştirin. Kemirgenlerde hipotermi, hayatta kalma oranlarını önemli ölçüde azaltır ve ameliyat sonrası iyileşme aşamasını uzatır.
- Kulak çubuklarını ve kesici çubukları konumlandırarak kafayı stereotaktik çerçeveye yerleştirin. Kulak çubukları için elmacık kemerini bulun ve çubukları kemerlerin arkasına yerleştirin. Kontralateral çubuğu baskın elinizle sabitleyerek başlayın (örneğin, sağ elinizi kullanıyorsanız sol çubuğu sağ elinizle sabitleyin) ve ardından karşı tarafı sabitleyin. Gerekirse vidaları çevirerek kulak ve kesici çubukların konumlarını ayarlayın.
- Gerekirse göz merhemini tekrar uygulayın ve gözleri örtmek için bir parça alüminyum folyo kullanın. Bu, daha sonra siyanoakrilat yapıştırıcıyı iyileştirmek için kullanılan parlak mikroskop ışığının ve UV ışığının neden olduğu herhangi bir hasarı önleyecektir (adım 2.5).
- Kesiden önce, ayak parmağı sıkıştırma refleksini tekrar kontrol edin; Gerekirse, anesteziyi buna göre ayarlayın. Sensörü arka pençeye yerleştirerek hayvanı anestezi izleme cihazına bağlayın. Kalp atış hızının ve kan oksijen konsantrasyonunun ölçülmesi, mortaliteyi azaltmaya ve ameliyat sonrası iyileşmeyi iyileştirmeye yardımcı olacaktır. Ek olarak, göğüs hareketini görsel olarak inceleyerek solunum hızını elde edin.
- Hipotermi ve kontaminasyonu önlemek için hayvanın vücudunu bir örtü ile örtün. Ameliyata başlamadan önce son bir povidon-iyot sürüntüsü yapın.
- Eldiven ve temiz bir laboratuvar önlüğü giyin.
NOT: Prosedürün invaziv olması ve 2P-IVM'de morbidite ve görüntü kalitesi kaybına neden olan herhangi bir postoperatif enfeksiyon ve inflamasyon riskini azaltmak için steril eldiven kullanılması teşvik edilmektedir (bölüm 5). - Kafatası üzerindeki deriyi kaldırın ve makası sağ göz ile kulak arasında tutarak ve kesi izlerini takip ederek kafatasının sol tarafına doğru keserek bir kesi oluşturun. Ortaya çıkan yuvarlak cilt kapağını çıkarın.
NOT: Beyindeki ilgilenilen bölgeye ve pencere boyutuna bağlı olarak kesi yeri ve çapı değişebilir. Montaj için yer sağlamak için insizyonun boyutunun başın çapından daha büyük olması gerekir (adım 2.5). Gerekirse, daha fazla alan yaratmak için insizyonu çevreleyen cilt nazikçe diseke edilebilir. - Kafatası yüzeyini bir neşter bıçağı veya bir mikrokurrette ile hafifçe çizerek periosteuumu çıkarın. Kraniyal sütürlerin etrafındaki periosteuumu çıkarırken dikkatli olun, çünkü bu bölgeler kırılgandır ve kanamaya daha yatkındır. Cerrahi alanı döküntülerden temiz tutmak için salin ve vakum kullanın. Siyanoakrilat yapıştırıcısına ve diş çimentosuna daha iyi yapışmayı sağlamak için periosteuumu çizin (adım 2.5)
- Hücre enjeksiyonunu gerçekleştirmek için beynin bölgesini tanımlayın. Bunun için fare beyninin stereotaktik koordinatlarının bir atlasını kullanın. Beyin koordinatlarına göre, pencereyle aynı çapta bir biyopsi zımbası, cerrahi bir kalem veya otoklavlanmış bir kalem kullanarak kraniyal pencerenin konumunu işaretleyin.
- Matkabı baskın elinizde ve diğer herhangi bir aleti (şırınga, forseps) baskın olmayan elinizde tutun. Aynı noktada uzun süreli delme işleminden kaçının. Matkap, aşırı ısınmayı önlemek için patlamalar halinde kullanılmalıdır. Bu molalar sırasında, cerrahi görünümü temiz tutmak ve aşırı ısınmayı önlemek için kalvaryuma soğuk salin uygulayın. Kafatasının ne zaman tamamen delindiğini tespit etmek için matkap ucundan gelen duyusal geri bildirimi kullanın.
- Kafatası yüzeyini temizlemek için vakumla birlikte soğuk tuzlu su kullanın. Kalvaryumu açtıktan sonra gazlı bez veya pamuk uçlu aplikatör kullanmayın, çünkü pamuk ipliği kalıntıları beyin penceresini kapattıktan sonra yabancı cisim reaksiyonuna neden olabilir.
- Delme sırasında, yörünge ve çapın cam lamel ile aynı boyutta olduğundan emin olun. Bunu, cam lamel kafatasının üstüne yerleştirerek ve cam lamellerin kafatası penceresinin içine tam olarak oturacağını onaylayarak yapın.
- Kafatası flebini hafifçe bastırarak bastırmak mümkün olduğunda, parçayı cerrahi alandan dikkatlice çıkarmak için forseps kullanın (Şekil 1B, solda). Kafatasını bastırmak henüz mümkün değilse, kafatasının geri kalanına hala bağlı olan kafatası penceresinin alanlarında delmeye devam edin ve yeniden değerlendirin.
- Küçük kanama meydana gelirse, kan kaybını azaltmaya yardımcı olmak için hafif basınçla birlikte hemostatik bir sünger veya alternatif olarak buz gibi tuzlu su kullanın.
- Hücre implantasyonu
- İmplante edilecek hücreleri (adım 1.7) açıklandığı gibi hazırlayın ve sayın. Hücre sayısının 200.000 hücre/μL olduğundan emin olun.
NOT: Hücrelerin RT'de katılaşan bir zar matrisinde askıya alınması önerilir. Bu, beyin parankiminde implante edilen hücrelerin başarı oranını artıracaktır. - Hücreleri buzlu bir kapta ameliyathaneye aktarın. Gaz geçirmez bir mikrolitre şırınga kullanın. Aspirasyondan önce, sıcaklık farklılıklarını önlemek için şırıngayı buz üzerinde tutun.
- 1 μL'yi aspire ettikten sonra, şırıngayı stereotaktik çerçevenin içine yerleştirin.
NOT: Zamandan tasarruf etmek için X, Y ve Z eksenlerindeki konumları gösteren otomatik bir stereotaktik koordinat cihazı kullanılabilir. Lambda'ya dayalı pozisyonları manuel olarak hesaplamak da mümkündür. 1,5 μL'den fazla enjekte edilmesi önerilmez. Bu, enjekte edilen alanın aşırı dolmamasını, başarısız implantasyona, beyin parankimi dışında büyümeye veya metastazlara neden olmamasını sağlayacaktır. - Beynin V2MM bölgesinde (görsel korteks 2, mediomedial kısım) implantasyon gerçekleştirin, bu da yaklaşık olarak medial ila lateral (ML): -1.2 ila -1.6 mm ve dorsaldan ventral (DV): -2.6 ila -3.5 mm koordinatlarına karşılık gelir.
- İki fotonlu görüntüleme için (adım 4.6), hücreleri yüzeysel beyin bölgelerine implante edin, böylece tümör kitlesi daha sonra kraniyal pencereden görselleştirilebilir. Önden arkaya (AP): 0,8 mm derinliğe 0,5 μL (100.000 hücre) enjekte edin. Beyne girerken iğneyi yavaş yavaş, kademeli olarak hareket ettirin ve enjeksiyondan sonra 30 saniye bekleyin (Şekil 1B, orta sütun).
- İğneyi geri çekerken ve beyin dokusundan çıkarken aynı yaklaşımı kullanın. Beyin omurilik sıvısı merkezi ve periferik sinir sistemlerinde metastazı teşvik edebileceğinden ventriküllere yakın enjekte etmekten kaçının.
- İmplante edilecek hücreleri (adım 1.7) açıklandığı gibi hazırlayın ve sayın. Hücre sayısının 200.000 hücre/μL olduğundan emin olun.
- Kraniyal pencerenin kapatılması
- Baş çubuğunu ve cam lamel alkolden tuzlu su çözeltisine taşıyın. Bu bileşenleri cerrahi bölgeye yönlendirmek için bir vakum ucu veya forseps kullanın.
- Cam lamel kafatası penceresinin içine yerleştirin ve kafatası ile cam lamel arasına az miktarda siyanoakrilat yapıştırıcı yerleştirin. UV ile aktive olan siyanoakrilat yapıştırıcı, kürlenme süresini azaltır ve kazara yer değiştirmeyi önler. Cam lamel üzerine herhangi bir yapıştırıcı dökülürse, tamamen kürlenmeden önce pamuklu uçlu bir aplikatör ile veya bir neşterin kör tarafıyla hafifçe çizerek çıkarın.
DİKKAT: UV ışığı gözler ve cilt için zararlıdır. Yapıştırıcıyı sertleştirirken göz ve cilt temasından kaçının. - Cam lamel kraniyal pencereye sabitledikten sonra baş çubuğunu uygulayın. İki bileşenli diş çimentosunu karıştırın, kafa çubuğunu konumlandırın ve çimentoyu kafatası ile kafa çubuğu arasında temas sağlayarak çevreye uygulayın. Gereksiz çimentoyu bir şırınganın ucu, neşter veya matkap ucu ile dikkatlice temizleyin.
NOT: Diş çimentosu çok çabuk katılaşır, bu nedenle zamanında uygulanması tavsiye edilir. - Kraniyal pencereyi kapattıktan sonra, diş çimentosu ile cilt arasındaki herhangi bir kafatası alanının hala açıkta olup olmadığını belirleyin. Bu durumda, cildi kapatarak kafatasını örtmek için cerrahi yapıştırıcı uygulayın. Alternatif olarak, emilebilir bir sütür materyali ile tek bir sütür gerçekleştirin.
3. Ameliyat sonrası iyileşme ve tümör büyümesi
- Kurtarma
- Hayvanı, tam bilincini geri kazanana kadar bir kurtarma kafesinde ısıtılmış bir ped üzerinde izleyin. Yaralanma riskini azaltmak için ameliyattan sonra hayvanları ayrı ayrı barındırın.
- Elektrolitler veya şekerler içeren ticari olarak temin edilebilen su jelleri gibi bir kurtarma diyeti uygulayın. Alternatif olarak, kolay beslenmeyi sağlamak ve dehidrasyon ve hipoglisemiyi önlemek için nemlendirilmiş standart laboratuvar yemi sağlayın.
- Izleme
- İyileştikten sonra, hayvanı ağrı, sıkıntı veya enfeksiyon belirtileri açısından günlük olarak izleyin. Gerekirse, analjezikler, antienflamatuar ilaçlar veya antibiyotikler uygulayın. Bir hayvan çalışma bitiş noktasına ulaşırsa, insancıl bir şekilde ötenazi yapın. Son görüntüleme seansını takiben, fareyi karbondioksit boğulması ve ardından servikal çıkık ile ötenazi yapın.
NOT: Erken ötenazi kriterlerine örnek olarak, bunlarla sınırlı olmamak üzere, önemli kilo kaybı (% >20), nörolojik bozukluklar, nefes darlığı, ameliyat sırasında aşırı kanama veya belirgin basmakalıp davranışlar dahildir. Kafatası penceresini inceleyin ve gerektiğinde tuzlu su veya alkolle temizleyin. - Tümör büyümesini izlemek ve görüntüleme zaman noktalarını planlamak için tüm vücut biyolüminesans görüntüleme (BLI) gerçekleştirin. Bunun için intraperitoneal olarak 150 mg/kg D-lusiferin enjekte edin ve 5-15 dakika sonra hayvanı görüntüleyin.
- İyileştikten sonra, hayvanı ağrı, sıkıntı veya enfeksiyon belirtileri açısından günlük olarak izleyin. Gerekirse, analjezikler, antienflamatuar ilaçlar veya antibiyotikler uygulayın. Bir hayvan çalışma bitiş noktasına ulaşırsa, insancıl bir şekilde ötenazi yapın. Son görüntüleme seansını takiben, fareyi karbondioksit boğulması ve ardından servikal çıkık ile ötenazi yapın.
4. Nanopartikül sentezi
- Parçacık hazırlama
- 50 mL 5 M NaOH, 20 mL deiyonize su (DI su) ve 20 mL epiklorohidrin içeren bir çözeltiye 11.17 mL Ferumoksitol (toplamda 6 mmol Fe) ekleyin. Bu aşamada faz ayrımını gözlemleyin. Karışımı RT'de 24 saat hafifçe çalkalayarak inkübe edin.
- 24 saat sonra, çözelti homojen hale gelir. 3 gün boyunca suya karşı diyaliz tüpü (12.000-14.000 Da kesme) kullanarak fazla epiklorohidrini çıkarın.
- Diyalizden sonra, tüpte kalan çözeltiyi bir cam şişeye aktarın (toplam hacim ~ 110 mL). 30 mL amonyak hidroksit ekleyin ve karışımı 37 °C'de 18-20 saat karıştırın.
- Karıştırdıktan sonra 3 gün boyunca suya karşı diyalizi tekrarlayın. Diyaliz tüpünde kalan çözeltiyi toplam hacmi ~110 mL olan yeni bir cam şişeye aktarın.
- Floresein izotiyosiyanat (FITC) konjugasyonu
- FITC konjugasyonu için 27.5 mL amin ile işlevselleştirilmiş parçacıkları çıkarın. Partikülleri 10 kDa'lık bir ultrasantrifüj filtresi kullanarak konsantre edin ve 10 dakika boyunca 25 ° C'de 5752 x g'de bir pH 9 (Na2CO3 / NaHCO3) tamponu ile yıkayın.
- Filtreye 4 mL çözelti ekleyin ve tüpü 10 dakika boyunca 25 ° C'de 5752 x g'de ultrasantrifüjleyin. Süzüntüyü atın ve aynı protokolle ikinci bir yıkama turu için filtreyi tamponla yeniden doldurun.
- Süzüntüyü atın ve çözeltiyi bir pipet kullanarak filtrede toplayın. Her parçacığın çapının 5 nm olduğunu varsayarak, parçacığın molar konsantrasyonunu Ferumoxytol'ün kütle konsantrasyonu ile tahmin edin.
- FITC'yi susuz dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 10 mg / mL'de çözün. Konsantre amin ile işlevselleştirilmiş partiküle yavaşça 1.4 mL DMSO çözünmüş FITC ekleyin. FITC: parçacığının molar oranı 20:1'dir. Bundan sonra, çözeltiyi karanlıkta 8 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- FazlaNH3 ekleyerek reaksiyonu söndürün. H2O(NH3'ün son konsantrasyonu. H2O 50 mM'dir), daha sonra çözeltinin karanlıkta 2 saat boyunca 4 ° C'de kalmasına izin verin. Na2CO3 / NaHCO3 (pH 9) tamponu kullanarak fazla FITC'yi 10 dakika boyunca 25 ° C'de 5752 x g'de 10 kDa'lık bir filtreden yıkayın. Çözeltinin nihai pH'ı, HCl sulu çözeltisi kullanılarak 7.4'e ayarlanır.
5. 2P-IVM
NOT: 2P-IVM seansları için, kafatası penceresinin konumunu yatay ve dikey olarak ayarlamaya izin veren özel bir aşamaya (Şekil 2 ve Ek Kodlama Dosyası 1) sahip bir Prairie Ultima IV mikroskobu kullanıldı. Son işlem ve görüntü analizi için Fiji yazılımı kullanıldı. Bu şekilde, lazer ışını cama 90 ° açıyla çarpacak şekilde ayarlanabilir, bu da artefaktları azaltır ve görüntüleme kalitesini artırır.
- Görüntüleme oturumu
- Ti-Sapphire lazeri açın. Ana sistem anahtarını ve Prairie View yazılımını açın.
- Hayvanı yukarıda tarif edildiği gibi uyuşturun (adım 2.2). Hayvan başına 2 saate kadar görüntüleme seansları gerçekleştirin. Anestezi komplikasyonları ve buna bağlı morbidite veya mortalite riskini azaltmak için görüntüleme süresini minimumda tutun.
- Özel bir aşama kullanarak fareyi iki foton mikroskobu altında hareketsiz hale getirin (Şekil 1B, sağ sütun). Hayvanı kemirgen cerrahisi için tasarlanmış ısıtılmış bir ped üzerine yüzüstü pozisyonda yerleştirin ve göğüs kafesi daraltmamaya dikkat ederken bant kullanarak hafifçe sabitleyin. Kafatası penceresine bir damla su damlatın ve odağı ayarlayın.
- Hayvanların hayati parametrelerini izlemek için kalp atış hızı ve kan oksijenasyonu elde edin. Sensörü arka pençeye yerleştirin ve izleme cihazını iki fotonlu görüntüleme odasının dışında tutun.
- Hayvan mikroskop aşamasına geldiğinde, baş pozisyonunu ayarlayın. Dürbün ve geniş alan floresan aydınlatmasını kullanarak kırmızı floresan protein (RFP) filtresini ayarlayın ve istenen görüntüleme görüş alanını bulun (Şekil 1B, sağ sütun).
- Numune oryantasyonu ve görüş alanı belirlendikten sonra, mikroskobu geniş alan modundan ışık tarama mikroskobu moduna (LSM) geçirin.
- Ti-Sapphire lazerin 920 nm'de mod kilitli olduğundan ve tüm panjurların açık olduğundan emin olun. GaAsP fotoçoğaltıcı tüp dedektörleri (PMT) voltajlarını 500-600 V'a kadar getirin. 595/50 (RFP) ve 525/50'de bant geçişli filtre setlerine sahip iki PMT kullanın.
- Canlı Görüntü'ye basın ve bir görüntü görünene kadar örnekteki lazer gücünü artırmak için pockel hücresini yavaşça değiştirin.
- Net bir görüntü elde edildikten sonra, istenen örnek alanı içinde bir görüntü yığınının üstünü ve altını ayarlamak için yazılımı ve motorlu aşamayı kullanın. Adım boyutuna dikkat edin ve Z ekseninin merceğin derinliğini ayarladığını göz önünde bulundurun.
- Derinlik arttıkça görüntüler koyulaşacaktır. Görüntüyü parlak tutmak için pockels/PMT kazancını yavaşça artırın. Fototoksisiteye ve doku hasarına yol açabileceğinden çok fazla güç kullanmamaya dikkat edin.
- Bir kaydetme yolu ayarlayın ve Z serisini başlatın. Ayarlanan pockel/PMT ayarlarını kullanarak otomatik olarak başlangıç ve bitiş konumlarına geçecektir. Yığın tamamlandıktan sonra, kalite için yığına bakmak için oynatmayı kullanın. Gerekli görüntülerin alınması tamamlandıktan sonra Ti-Sapphire lazeri kapatın.
- Hayvanı yukarıda açıklandığı gibi bir kurtarma kafesine taşıyın (adım 3.1).
- Prairie görünümünden çıkın ve tüm verilerin kaydedildiğinden/aktarıldığından emin olun. Bilgisayarı kapatın ve tüm donanımı kapatın.
- FIJI ile işlem sonrası
NOT: Fiji, biyolojik görüntü analizine odaklanan açık kaynaklı bir yazılımdır21.- İşletim sistemine göre FIJI'yi indirin. Klasör içeriğini açın ve .exe dosyasını çalıştırın.
- İki fotonlu görüntülemeden toplanan .env dosyasını iletişim kutusuna sürükleyin. Kanalları farklı görüntü kutularına bölün. Bu, biri hücre sinyalini, diğeri parçacık sinyalini içeren farklı kanallara sahip iki farklı görüntü oluşturacaktır.
- Resimlerden birini kopyalayın ve başka bir resim oluşturmak için Dosya > Yeni > Dahili Pano'ya tıklayın. Görüntülerden birini Kaynak , diğerini Kopyala olarak yeniden adlandırın.
- Kopyalanan görüntüyü kullanın ve diyalog kutusunda İşlem > Kontrastı geliştir'e tıklayın. Normalleştir ve Tamam'ı ve ardından Düzgünleştir'> İşle'yi tıklatın. Bu görüntü, analiz için değil, maske oluşturmak için kullanılır. Diyalog kutusunda Görüntü > > Eşiği Ayarla'ya tıklayın. Ayıklamak için uygun olan kayan ölçeği ve yöntemi kullanın, ardından Uygula'yı tıklayın.
- Arka planda tek pikselleri aşındırmak için İşlem > İkili > Aşındır'ı kullanın ve görüntüye pikselleri geri eklemek için İkili > Genişlet > İşle'yi tıklatın.
- İletişim kutusunda Görüntü Hesaplayıcı > İşleme'ye tıklayın, ilk olarak kaynak görüntüyü seçin ve ikinci görüntüyü Kopyala olarak seçin. Her iki görüntünün kesişimini oluşturmak için AND kullanın. Diğer kanal görüntüsü için aynı adımı tekrarlayın.
- Vasküler bölge dışındaki sinyal analizi için, değiştirilmemiş kopyalanmış bir görüntü açın ve Freehand ROI aracıyla sinyalin vasküler alanını silin.
- Analiz Et > Ölçümleri Ayarla'ya giderek istediğiniz parametreleri ayarlayın. Area, Integrated Density (Entegre Yoğunluk) ve Mean Gray Value (Ortalama Gri Değer) seçeneklerinin işaretli olduğundan emin olun.
- Şimdi Analiz > Ölçü ile analiz edin. Ölçümleri içeren bir pencere açılacaktır. Verileri bir elektronik tabloya kopyalayın.
- Şimdi görüntünün floresan olmayan küçük bir alanını seçin. Bu arka plan olacak.
- Bu bölge için Analiz > Ölç'e tıklayın. Verileri bir e-tabloya kopyalayın.
- Elde edilen görüntüyü Dosya > olarak kaydedin > Yeniden ölçümler veya yayınlama amacıyla dosya türünü analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada kraniyal pencere cerrahisi uyguladık ve GBM'nin NSG fare modelinde C6 hücrelerini aşıladık (n=5). Pencerenin oluşturulmasında yer alan tüm bileşenler arasında uygun bir sızdırmazlık (Şekil 1A), pencerelerin uzun süreli görüntüleme için dayanıklılığını sağlayacak ve ayrıca morbiditeyi azaltacaktır. İn vivo 2P-IVM için uyarlanmış aşamayı kullanarak (Şekil 2), anestezi altındaki hayvanları herhangi bir büyük hareket artefaktı olmadan 2 saate kadar görüntüleyebildik. GBM taşıyan farelerde nanopartiküllerin intravenöz uygulamasından yaklaşık 10 dakika sonra, 2P-IVM, FITC etiketli nanopartiküllerin intravasküler lokalizasyonu ile tutarlı olarak, tümör bölgesindeki damarların yeşil, floresan sinyalini gösterir. Kan damarlarının dışında sadece az miktarda yeşil floresan sinyal not edilir, bu da NP'lerin başlangıç ekstravazasyonunu gösterir (Şekil 3A). Ekstravasküler boşluktan kaynaklanan FITC sinyalinde ileri ekstravazasyona paralel bir artış görülür (Şekil 3B).
Şekil 1. Kraniyal pencere yerleştirme, kraniyotomi, implantasyon ve görüntüleme. (A) Bir kraniyal pencerenin anatomik yerleşiminin kesiti. Başlık çubuğu metal içermediğinden, iki fotonlu intravital mikroskopiye ek olarak manyetik rezonans görüntüleme veya manyetik parçacık görüntüleme yapmak mümkündür. (B) Kraniyotomi (solda), hücre implantasyonu (ortada) ve 2-foton intravital mikroskopisinin (sağda) genel görünümü (üst sıra) ve ayrıntılı bir görünümü (alt sıra). Kafatası açıldıktan sonra yüzeysel kanama meydana gelir (solda) ve hızla yeniden emilir (ortada). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Sahnenin bilgisayar destekli tasarımı (CAD). Bir ısırma çubuğu, kafa çubuğu stabilizasyonu ve yükseklik ve açı ayarlamaları için vidalar dahil olmak üzere in vivo 2-foton intravital mikroskopi için kullanılan sahnenin CAD'i. 3D CAD dosyası Ek Kodlama Dosyası 1'de bulunabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. İn vivo 2-foton intravital mikroskopi görüntüleri. İntravenöz nanopartikül uygulamasından (A) 10 dakika ve (B) 24 saat sonra elde edilen görüntüler. GBM hücreleri kırmızı spektrumda (solda) floresan sinyalleri yayarken, beyin dokusundaki nanopartiküller yeşil renkte (sağda) görselleştirilir. # ekstravaze NP'leri, * bir kan damarını gösterir. Sadece sınırlı sayıda partikül ekstravazasyona uğramıştır ve NP uygulamasından 10 dakika sonra tümör hücrelerinin yakınında görülebilir. GBM hücrelerinin bölgesinde bol miktarda partikül görülebilir, bu da NP uygulamasından 24 saat sonra ekstravazasyonu düşündürür. Nanopartiküller, floresein izotiyosiyanat (FITC) ve demir oksit nanopartiküllerinden (Ferumoxytol) oluşur. Ölçek çubukları 100 μm'yi temsil eder. Kısaltmalar: 2P-IVM: 2-foton intravital mikroskopi, RFP: kırmızı floresan proteini, GBM: glioblastom, FITC: floresein izotiyosiyanat, NP: nanopartiküller. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Kodlama Dosyası 1: Sahnenin 3D CAD dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Floresan etiketli demir oksit NP'lerin tümör iletimini değerlendirmek için bir kraniyal pencereden 2P-IVM kullanarak gerçek zamanlı in vivo NP takibi için bir yöntem sunuyoruz. Bu prosedür için cerrahi teknik, sabit bir el ve ileri deneysel cerrahi beceriler gerektirir. Canlı hayvan deneyimine geçmeden önce karkaslar veya hayaletler kullanarak pratik yapmanız önerilir. Alternatif olarak, Hoeferlin ve ark. termal hasarı azaltmak, cerrahi teknik değişkenliğini en aza indirmek ve cerrahiyi standartlaştırmak için robotik bir matkap uyguladı22.
Pencerenin boyutu başka bir kritik parametreyi temsil eder. Daha büyük bir pencere, tümörün daha büyük bir kısmının 2P-IVM ile görüntülenmesini sağlayacaktır. Literatürde 3-7 mm arasındaki boyutlar tanımlanmıştır23. Bununla birlikte, daha büyük pencereler beyin eğriliğine uyum sağlayamaz ve bu da bölgesel basıncın artmasına neden olabilir24. Bu kısıtlamanın üstesinden gelmek için, bunun yerine "cam kafatası" olarak adlandırılan bir kafatası kullanılabilir25. Geleneksel cam pencerelerle karşılaştırıldığında, bu yöntem beyin eğriliğini barındıran ve böylece korteks üzerindeki odak basıncını azaltırken daha büyük pencerelerin oluşturulmasına izin veren kavisli cam kullanır. Bu tip kavisli cam ticari olarak mevcut değildir ve yalnızca 2P-IVM'de sınırlı uygulamalara sahiptir, çünkü kavisli yüzey yansıma artefaktlarına neden olarak pencerenin görüntülenebilecek alanını sınırlar. Diğer bir alternatif ise silikon bazlı bir pencere24'tür. Bir yandan bu yöntem, oluşturulacak pencerenin boyutu ve biçimi konusunda daha fazla esneklik sunar. Ek olarak, pencere arızası ve iltihaplanma oranları açısından klasik cam pencerelerle karşılaştırılabilir sonuçlar bildirilmiştir. Öte yandan, polimer esaslı pencerelerde 2 fotonlu görüntüleme kalitesinin cam pencerelere göre daha hızlı düştüğü ve uzun süreli uygulamalar için uygun olmadığı gösterilmiştir26. İnceltilmiş bir kafatası kraniyal penceresi başka bir alternatifi temsil eder. Klasik cam pencereden daha az invaziv olmakla birlikte, burada tarif edilenle aynı tekniği kullanarak GBM hücre implantasyonuna izin vermez. Ek olarak, tutarlı bir kafatası kalınlığı elde etmek zordur ve sonuç olarak bu, 2P-IVM27'de önemli artefaktlara neden olabilir.
Hücre hattı ve implante edilen GBM hücrelerinin miktarı, çalışma zaman çizelgesini planlarken göz önünde bulundurulması gereken diğer önemli hususlardır. C6 sıçan glioma hücre hattı, GBM araştırmalarında en yaygın kullanılan hücre hatlarından biridir. Sıçanlarda ve farelerde, intrakraniyal implantasyonlar için 5 x 104 ve 5 x 106 arasında hücre sayıları bildirilmiştir 27,28,29,30,31. Genel bir kural olarak, daha fazla sayıda hücre implante edilirken, daha hızlı tümör büyümesi beklenir. Bu protokolde 1 x 105 hücre implante edildi ve implantasyon sonrası 11. ve 12. günlerde görüntüleme yapıldı. Xin ve ark. BALB / c çıplak farelere 1 x 105 C6 hücresi implante etti ve implantasyondan sonraki 7. günde MRG'de ileri GBM tespit ettiğini ve 15 gün sonra mortalitenin arttığını bildirdi30. Buna karşılık, Jia ve ark. daha fazla sayıda hücre (1 x 106) ve aynı fare suşu kullandı ve MRG'de 7. günde, GBM dokusunda soluk bir Evans mavisi lekesi ile gösterildiği gibi, hafifçe bozulmuş bir kan-beyin bariyeri (BBB) ile küçük bir tümör kitlesi tespit etti32. 14. günde, Evans mavi lekesi 7. günden daha güçlüydü ve bu da BBB'nin oldukça bozulduğunu gösteriyor. Buna karşılık, tümör büyümesi, hayvanların deneyde ne kadar süre tutulabileceğini de etkiler. Bu, uzunlamasına görüntüleme çalışmaları için hayvan refahının önemli bir hususudur. Kronik kraniyal pencerelerin implantasyondan sonra 6 aya kadar görüntüleme için uygun olduğu bildirilmiştir26.
Bu protokolde kullanılan nanopartiküller demir oksit ve florofor bileşenlerinden oluşmaktadır. Olası uygulamalar arasında yeni terapötik ilaçların, hücresel terapötiklerin tümör iletiminin araştırılması ve tümör damar sistemi ve tümör mikroçevresi üzerindeki müdahaleler yer alır. Farklı ilaç adayları ve kombinasyon tedavileri hücresel ve moleküler düzeyde değerlendirilebilir. NP'lerin demir oksit bileşeni, 2P-IVM'ye ek olarak MRI veya manyetik parçacık görüntüleme ile multimodal görüntülemeye izin verir. MRG klinik olarak anlamlı bir görüntüleme yöntemini temsil ederken, anatomik çözünürlüğü intravital mikroskopiden daha düşüktür33.
Bu yöntemin de belirli sınırlamaları vardır. Fare beyin atlasına göre beyin koordinatları C57BL/6J fareler için standartlaştırılmıştır ve fare türüne, cinsiyetine ve yaşına bağlı olarak ayarlanmalıdır. Ayrıca, iki fotonlu görüntüleme ile yalnızca yaklaşık 450 μm'lik sınırlı bir derinliğe erişilebilir9. Bu nedenle, 2P-IVM ile tümörün sadece kısmi karakterizasyonu mümkündür ve tümör özelliklerindeki bölgesel farklılıklar gözden kaçabilir. Ek olarak, NP yönetimini takip eden yalnızca iki zaman noktası dahil edildi. İntravenöz uygulamadan sonra daha fazla zaman noktası içeren gelecekteki çalışmalar, tümör mikroçevresindeki NP'lerin uzay-zamansal davranışının daha ayrıntılı bir analizine izin verecektir.
Sonuç olarak, bir GBM fare modelinde 2P-IVM kullanarak floresan etiketli demir oksit nanopartiküllerinin tümör iletimini değerlendirdik. Bu yöntem, çeşitli araştırma alanlarına uyacak şekilde kolayca değiştirilebilir ve sinirbilim alanında in vivo beyin görüntüleme için önemli bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Stanford Wu Tsai Nörobilim Mikroskopi Servisi'ne, Stanford In Vivo Görüntülemede Yenilikler Merkezi'ne (SCi3) - küçük hayvan görüntüleme merkezine, NIH S10 Paylaşılan Enstrümantasyon Hibesi'ne (S10RR026917-01, PI Michael Moseley, Ph.D.) ve Porter Drive'daki Stanford Klinik Öncesi Görüntüleme Tesisi'ne bu proje için ekipman ve altyapı sağladıkları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsani Gelişme Enstitüsü'nün R01HD103638 numaralı hibesi ile desteklenmiştir. Schnitzer Group, Stanford Üniversitesi'ne teşekkür ederiz; Zuo laboratuvarı, Santa Cruz Üniversitesi; ve Nörovasküler Görüntüleme Laboratuvarı, Boston Fotonik Merkezi, Boston Üniversitesi, iki foton görüntüleme ve kraniyal pencere modelleri üzerine eğitim tartışmaları için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride infusion solution | Baxter Corp | 533-JB1301P | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium |
Invitrogen | 11965-092 | |
| 1 mL syringes | BD | Luer-Lok syringe, REF309628 | |
| 10% FBS | Thermo fisher | Cytiva SH30910.03HI | |
| 10% DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| 2-photon microscope | Prairie Technologies, Bruker | Prairie Ultima IV | |
| Alcohol applicators, 70% | Medline Industries, LP | MDS093810 | |
| Alcohol, spray bottle | Decon Labs Inc | Decon SaniHol, 04-355-122 | |
| Aluminum foil | Reynold Brands | Reynold Wrap non-stick aluminum foil | |
| Anesthesia machine | Patterson Scientific | SAS3 | |
| Anesthesia monitoring | Kent Scientific | MouseSTAT Jr. Rodent Pulsoxymeter | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x), liquid | Invitrogen | 15240-096 | |
| Betadine applicators | Professional Disposables International, Inc | S41125 | |
| Biopsy punch, 5 mm | Miltex | Size 5 | |
| Buprenorphine sustained release | Zoo Pharm | Bup SR Lab, 1.0 mg/mL | A generic drug can be used instead. |
| C6 rat glioma cell line | ATCC (American Tissue Culture Collection) | CCL-107 | |
| Cannulas | BD | 16 G, 1.1/2”, 30 G, 1” | |
| Carprofen | Pfizer | Rimadyl, 50 mg/ml | A generic drug can be used instead. |
| Cefazoline | Sagent Pharmaceuticals | 25021-101-10, 1 g/vial | A generic drug can be used instead. |
| Cell strainer, 40 µm | Fisher Scientific | 87711 | |
| Cotton tip applicators, 6” | Dyad Medical Sourcing, LLC | HCS1005 | |
| Dental cement | Stoelting Co | 51459 | Dental cement kit, clear, 2 components |
| Dexamethasone | Bimeda | 138RX, 2 mg/mL | A generic drug can be used instead. |
| DietGel | ClearH2O | Recovery, 72-06-502 | |
| Drape | Cardinal Health | Bio Shield Wrap | |
| Drill | Saeyang Microtech | Escort Pro, B08350 | |
| Drill tips | Hager & Meissinger GmbH | REF310104001001005 | Size 005, US 1/4 |
| FIJI imaging analysis software | National Institute of Health | https://imagej.net/software/fiji/ | |
| Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | |
| Gauze | Fisher HealthCare | Sterile Cotton Gauze Pad, 4 x 4”, 22-415-469 | |
| Gelfoam | Ethicon Inc. | Surgifoam absorbable gelatin sponge, Ref. 1972 | |
| Germinator | Cellpoint Scientific | Germinator 500, No. 11688 | |
| Glass coverslips, 5 mm diameter | Fisher Scientific | Menzel Cover glass | |
| Gloves, non-sterile | Fisher Scientific | Nitrile powder-free medical examination gloves | |
| Gloves, sterile | Medline Industries, LP | MDS104070 | |
| Hair removal cream | Church & Dwight | Nair Hair remover lotion | |
| Hamilton syringe | Hamilton Company Inc | Gastight #1701, 10 µL | |
| HBSS without Ca, Mg | Fisher Scientific | PI88284 | |
| Head bar | Hongway | 5 mm inner diameter O-rings | |
| Heating pad | Stoelting Co. | Rodent warmer X2 | |
| Insulin syringes | Exel International Medical Products | 29G x 1/2″ | |
| Iron oxide nanoparticles | Covis Pharma GmbH | Feraheme ferumoxytol injection, 510 mg/17 mL, 59338077501 | |
| Isoflurane | Dechra | 26675-46-7 | |
| Mice | Jackson Laboratories | NSG, Strain 005557 | |
| Microscope (surgery) | Seiler Medical | Seiler IQ Q-100-220 | |
| Nanoparticles | Custom | Iron oxide nanoparticles (Ferumoxytol) labeled with fluorescein isothiocyanate | |
| Ophtalmic ointment | Major pharmaceuticals | Lubrifresh P.M. nighttime ointment, 203964 | |
| Oxygen | Linde Gas & Equipment Inc. | High Pressure Steel K Style Cylinder, 249CF, 2000PSIG, CGA 540 | |
| Plastic cups | Georgia-Pacirif Consumer Products | Dixie Portion Cup, 2 oz., Plastic, Clear, PK2400 | |
| Polyethylene tubing | Braintree Scientific | 50-195-5494 | |
| Scale | Ohaus Corp | CR2200 | |
| Scalpel | Integra Life Sciences Production Corp | Integra Miltex Stainless steel disposable scalpel | |
| Scissors | Fisher Scientific | 13-804-18 | |
| Sealant | Henkel Corp | Loctite 4014 | |
| Single use lab gown | High Tech Conversions | 17-444-081 | |
| Stereotactic frame | Stoelting Co. | Stoelting New Standard TM | |
| Sterile Vacuum Bottle Top Filtration Systems | Fisher Scientific | S2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE | |
| Styrofoam box | N/A | N/A | |
| Surgical gloves | Cardinal Health | 19-163-108 | |
| Surgical glue, 3M Vetbond tissues adhesive | 3M Animal Care Prodcuts | 1469SB | |
| Tail vein cathether | Custom | Consists of two 30 G cannulas connected with sillicone tubing | |
| TrypLE Express (1x), no phenol red | Invitrogen | 12604-039 | |
| Ultraviolett torch | Spring sunshine technology | Consciot |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Wang, Z., McCracken, S., Williams, P. R. Transpupillary two-photon in vivo imaging of the mouse retina. J Vis Exp. 168, 61970 (2021).
- Zhang, K., et al. In vivo two-photon microscopy reveals the contribution of Sox9+ to kidney regeneration in a mouse model with extracellular vesicle treatment. J Biol Chem. 295 (34), 12203 (2020).
- Jang, W. H., et al. Two-photon microscopy of Paneth cells in the small intestine of live mice. Sci Rep. 8 (1), 14174 (2018).
- Ihler, F., Bertlich, M., Weiss, B., Dietzel, S., Canis, M. Two-photon microscopy allows imaging and characterization of cochlear microvasculature in vivo. Biomed Res Int. 2015, 154272 (2015).
- Matsuura, R., et al. Intravital imaging with two-photon microscopy reveals cellular dynamics in the ischeamia-reperfused rat heart. Sci Rep. 8 (1), 15991 (2018).
- Veres, T. Z., et al. Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy. Sci Rep. 7 (1), 694 (2017).
- Zong, W., et al. Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice. Cell. 185 (7), 1240-1256.e30 (2022).
- Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain. eNeuro. 17 (1), (2019).
- Birkner, A., Konnerth, A. Deep two-photon imaging in vivo with a red-shifted calcium indicator. Methods Mol Biol. 1929, 15-26 (1929).
- Busche, M. A. In vivo two-photon calcium imaging of hippocampal neurons in Alzheimer mouse models. Methods Mol Biol. 1750, 341-351 (2018).
- Li, L., et al. A sensitive two-photon probe to selectively detect monoamine oxidase B activity in Parkinson's disease models. Nat Commun. 5, 3276 (2014).
- Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (3), (2013).
- Ricard, C., et al. Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice. Sci Rep. 6, 26381 (2016).
- Soubéran, A., et al. Effects of VEGF blockade on the dynamics of the inflammatory landscape in glioblastoma-bearing mice. J Neuroinflammation. 16 (1), 191 (2019).
- Zhang, W., et al. Real-time vivo reveals specific nanoparticle target binding in a syngeneic glioma mouse model. Nanoscale. 14 (15), 5678-5688 (2022).
- Wartchow, K. M., et al. Treatment with cyclic AMP activators reduces glioblastoma growth and invasion as assessed by two-photon microscopy. Cells. 10 (3), 556 (2021).
- Jiang, L. W., et al. Label-free detection of fibrillar collagen deposition associated with vascular elements in glioblastoma multiforme by using multiphoton microscopy. J Microsc. 265 (2), 207-213 (2017).
- Chen, Z., Ross, J. L., Hambardzumyan, D. Intravital 2-photon imaging reveals distinct morphology and infiltrative properties of glioblastoma-associated macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (28), 14254-14259 (2019).
- Zhang, Y. S., et al. Labeling human mesenchymal stem cells with gold nanocages for in vitro and in vivo tracking by two-photon microscopy and photoacoustic microscopy. Theranostics. 3 (8), 532-543 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hoeferlin, G. F., Menendez, D. M., Krebs, O. K., Capadona, J. R., Shoffstall, A. J. Assessment of thermal damage from robot-drilled craniotomy for cranial window surgery in mice. J Vis Exp. 189, 64188 (2022).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Sci Rep. 6, 27818 (2016).
- Kim, T. H., et al. Long-term optical access to an estimated one million neurons in the live mouse cortex. Cell Rep. 17 (12), 3385-3394 (2016).
- Kılıç, K., et al. Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice. Front Physiol. 11, 612678 (2021).
- Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. Analysis of optical properties of the mouse cranium-implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 178 (2), 316-322 (2009).
- Lu, W., Sun, Q., Wan, J., She, Z., Jiang, X. G. Cationic albumin-conjugated pegylated nanoparticles allow gene delivery into brain tumors via intravenous administration. Cancer Res. 66 (24), 11878-11887 (2006).
- Zhang, B., et al. LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma. Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).
- Xin, H., et al. Enhanced anti-glioblastoma efficacy by PTX-loaded PEGylated poly(ɛ-caprolactone) nanoparticles: In vitro and in vivo evaluation. Int J Pharm. 402 (1-2), 238-247 (2010).
- Valable, S., et al. In vivo MRI tracking of exogenous monocytes/macrophages targeting brain tumors in a rat model of glioma. Neuroimage. 40 (2), 972 (2008).
- Jia, Y., et al. Phototheranostics: Active targeting of orthotopic glioma using biomimetic proteolipid nanoparticles. ACS Nano. 13 (1), 386-398 (2021).
- Asan, L., et al. Cellular correlates of gray matter volume changes in magnetic resonance morphometry identified by two-photon microscopy. Sci Rep. 11, 4234 (2021).
