Summary
אנו מציגים גישה חדשנית למיקרוסקופ דו-פוטוני של העברת הגידול של ננו-חלקיקי תחמוצת ברזל עם תווית פלואורסצנטית לגליובלסטומה במודל עכבר.
Abstract
מתן טיפול בסרטן תוך ורידי לגידולי מוח מוגבל על ידי מחסום הדם-מוח. שיטה להדמיה ישירה של הצטברות והפצה של מקרומולקולות בגידולי מוח in vivo תשפר מאוד את יכולתנו להבין ולייעל מתן תרופות במודלים פרה-קליניים. פרוטוקול זה מתאר שיטה למעקב בזמן אמת in vivo של ננו-חלקיקים בעלי תווית פלואורסצנטית תוך ורידית במיקרוסקופ תוך-חיוני של שני פוטונים (2P-IVM) במודל עכברי של גליובלסטומה (GBM).
הפרוטוקול מכיל תיאור רב-שלבי של ההליך, כולל הרדמה ושיכוך כאבים של חיות ניסוי, יצירת חלון גולגולתי, השתלת תאי GBM, הנחת מוט ראש, ביצוע מחקרי 2P-IVM וטיפול לאחר ניתוח למחקרי מעקב ארוכי טווח. אנו מציגים מפגשי הדמיה 2P-IVM מייצגים וניתוח תמונה, בוחנים את היתרונות והחסרונות של טכנולוגיה זו ודנים ביישומים פוטנציאליים.
שיטה זו ניתנת לשינוי והתאמה בקלות לשאלות מחקר שונות בתחום דימות המוח הפרה-קליני in vivo .
Introduction
מיקרוסקופ תוך-ויטלי דו-פוטוני (2P-IVM) היא טכניקת הדמיה פלואורסצנטית המאפשרת הדמיה של רקמה חיה1.
פותח לראשונה בשנות התשעים, 2P-IVM שימש לניתוח in vivo של הרשתית2, כליות3, מעי דק4, שבלול5, לב6, קנה הנשימה7, והמוח במודלים פרה-קליניים שונים 8,9. בתחום מדעי המוח, 2P-IVM צברה חשיבות כטכניקה לדימות בזמן אמת של המוח הבריא בחיות ערות10, כמו גם לחקר מחלות של מערכת העצבים כגון אלצהיימר11, פרקינסון12 וגליובלסטומה (GBM)13,14,15,16.
2P-IVM מציעה פתרון אלגנטי לחקר המיקרו-סביבה של הגידול במהלך התפתחות GBM. בעוד שחלק מהמחקרים הקודמים התמקדו במודלים במבחנה17 ו-ex vivo 18, אחרים יישמו מודלים אורתוטופיים19 וקסנוטרופיים20 in vivo לבחינת GBM. Madden et al. ביצעו הדמיה טבעית של קו תאי גליומה של חולדה CNS-1 במודלעכבר 13. באמצעות מודל אורתוטופי GL261-DsRed murine, ריקארד ואחרים ביצעו מתן תוך ורידי של פלואורופור כדי לשפר את כלי הדם באזור הגידול ב 2P-IVM14.
כאן, אנו מיישמים 2P-IVM למעקב אחר העברת הגידול של ננו-חלקיקי תחמוצת ברזל עם תווית פלואורסצנטית (NP) במודל עכבר אורתוטופי של GBM. באמצעות חלון גולגולתי, שיטה זו מאפשרת לנו לחקור את ההתפלגות המרחבית-זמנית בזמן אמת של NPs במוח בפירוט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
נוהל בעלי החיים המתואר בפרוטוקול זה הוא בהתאם לדרישות הפאנל המנהלי לטיפול בחיות מעבדה (APLAC).
1. תרבית תאים
- הכנת מכסה המנוע
- שטפו ידיים, לבשו כפפות ומעיל מעבדה. הפעל את ארון הבטיחות הביולוגי וקבע את מפלס האבנט לגובה פתיחה מתאים. תנו למכסה המנוע להתנקות במשך 3-5 דקות. רססו את אזור מכסה המנוע באתנול 70% ונגבו אותו בנייר טישו.
- רססו את כל הריאגנטים באתנול 70% ונגבו בנייר טישו. העבירו את הריאגנטים לתוך מכסה המנוע. אין להניח פריטים על הגריל. אם מתרחשת שפיכה במכסה המנוע, כסו אותו במגבונים, רססו אותו באתנול 70% ונגבו שוב.
- לאחר הניסוי, סגרו בזהירות את המכסים של כל פריט, נגבו את כל החומרים, הוציאו פריטים ממכסה המנוע והעבירו אותם למיקומם המקורי. רססו 70% אתנול במכסה המנוע ונגבו אותו. סגרו את האבנט וכבו את ארון הבטיחות הביולוגי.
- הכנת מדיום גידול
- הוסף 50 מ"ל של 100% סרום בקר עוברי (FBS) ל- 500 מ"ל מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM). הוסף 5 מ"ל של פתרון אנטיביוטי-אנטי-מיקוטי (100x).
- מעבירים את כל הריאגנטים דרך בקבוק סינון סטרילי של 500 מ"ל (מסנן 0.22 מיקרומטר).
- הפשרת תאים שמורים בהקפאה
- במכסה מנוע זרימה למינרית, הוסף 20 מ"ל של מדיום הגידול לצלוחית T75. תייגו את הבקבוק עם שם התאים, התאריך ומספר המעבר על הצלוחית. במחקר זה נעשה שימוש בתאי גליומה C6 דבקים.
- הפשיר תאים במהירות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. אין לערבל את התאים. להפשיר ומיד להשתמש בתאים.
- מעבירים את התאים המופשרים לבקבוק T75 בעזרת קצה פיפטה בנפח 1 מ"ל. היזהר לא להציג בועות במהלך תהליך ההעברה, ולהימנע מכל שאריות בינוניות בצוואר של הצלוחית. זה יכול להגדיל את הסיכון לזיהום אפשרי.
- שינוי המדיום
- שנה את המדיום ביום שלאחר ההפשרה כדי להסיר שאריות טריפסין או דימתיל סולפוקסיד (DMSO) (שלב 1.6). לאחר מכן, שנה את המדיום לפחות פעמיים בשבוע או יותר, בהתאם לרמת מפגש התא. המדיום חייב להיות שונה יום אחד לאחר המעבר כדי לחסל טריפסין.
- כדי לשנות את המדיום, הפעל את מנגנון השאיפה, חבר את פיפט זכוכית השאיפה, ושאף את כל המדיום.
- הוסף 20 מ"ל של מדיום הצמיחה (שלב 1.2).
- העברת התאים
- טען את מכסה המנוע עם הפריטים הדרושים במהלך הניסוי.
- השתמשו בצינור זכוכית שאיפה ושאפו החוצה את כל המדיה, וודאו שפיפטת הזכוכית נמצאת בצד הלא-תאי של הצלוחית. עבור שלב זה, מקם את בקבוק T75 אנכית.
- הוסף ~ 10 מ"ל של מלח חוצץ פוספט בטמפרטורת החדר (ללא PBS, Ca++ ו- Mg++) או תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (ללא HBSS, Ca++ ו- Mg++) בצד שאינו תא. שטפו תאים לזמן קצר עם PBS על ידי מיקום אופקי של בקבוק T75 כשצד התא פונה כלפי מטה.
- הניחו מיד את הבקבוק במאונך ושאפו את PBS/HBSS. יש לחזור על השטיפה והשאיפה 3 פעמים.
- הוסף 2 מ"ל טריפסין (רקומביננטי או מופק מן החי) בצד התא (בקבוק T75 אופקי, צד התא פונה כלפי מטה). יש לדגור באינקובטור תרבית רקמה סטנדרטי (37°C, 5% CO2) למשך 4 דקות. Triturate אותו פעם אחת לאחר 2 דקות באמצעות פיפטה 5 מ"ל.
- לאחר 4 דקות של דגירה כוללת, להעביר את הפתרון לצינור חרוטי 15 מ"ל. הוסף 8 מ"ל של תמיסת הצמיחה לצינור החרוטי (2 מ"ל תאים טריפסיניים + 8 מ"ל של בינוני = 10 מ"ל בסך הכל).
- השתמש עוד צינור חרוטי ריק 15 מ"ל עם מסנן ולהעביר את התאים דרך פיפטה 25 מ"ל כדי להשיג תאים בודדים.
- העבר 1/10 (1 מ"ל) של התמיסה (תא + מדיה + Tryp-LE) לבקבוק T75 עם 20 מ"ל של מדיה. לחלופין, ספור את התאים (שלב 1.7). שנה את המדיה למחרת כדי לקבל פתרון מדיה שאינו טריפסין.
- הקפאת המדיום והתאים
- הפשירו 100% FBS במקרר 4°C. אין להשתמש באמבט מים או בחום מכיוון שהדבר עלול לפגוע בחלבונים ב- FBS.
- כדי להכין 50 מ"ל של מדיה מקפיאה, לערבב 45 מ"ל של DMEM, 5 מ"ל של FBS, ו 5 מ"ל של DMSO. יש לרכז אותו במיכלים של 1-2 מ"ל כדי למנוע הפשרה לסירוגין ונזקי חלבון. אחסנו אותם במקפיא -20 ° או -80 °C.
- עבור 9 מ"ל הנותרים של פתרון (שלב 1.5), להוסיף 1 מ"ל של בינוני כדי להגיע 10 מ"ל בסך הכל. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 4 דקות.
- יש להסיר את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש ב-1 מ"ל של מדיום הקפאה (ראה לעיל). הניחו את התאים במיכל הקפאה במקפיא של -80°C. העבר את התאים לנוזל N2 לאחסון לטווח ארוך לאחר יום או יומיים.
- ספירת התאים
- עבור 9 מ"ל הנותרים (שלב 1.5), הוסף 1 מ"ל של מדיה כדי להגיע ל -10 מ"ל בסך הכל. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 4 דקות.
- הסר את supernatant ו resuspend ב 4 מ"ל של HBSS. Resuspend 10 μL של תאים ב 80 μL של HBSS + 10 μL של 0.4% Trypan כחול, גורם דילול = 10.
- קח 17 μL של הפתרון ולספור ארבעה 4 x 4 ריבועים בהמוציטומטר. ממוצע נחשב עבור ארבעת 4 x 4 ריבועים ומכפיל ב 104x גורם דילול כדי לקבל תאים / מ"ל.
2. ניתוח
הערה: מומלץ לבצע את הניתוח על ידי שני חוקרים, כאשר אדם אחד אחראי על הכנת התאים, ערבוב המלט הדנטלי ובאופן כללי סיוע בהליך, ואילו האדם השני מתמקד בשמירה על סטריליות. לאחר מניפולטור שני כדי לסייע עם הליך כירורגי מקטין באופן משמעותי את הסבירות של זיהום להתרחש. הקפדה על שיטות כירורגיות מיטביות תפחית את הסיכויים לסיבוכים לאחר הניתוח. איור 1A מספק סקירה כללית של מרכיבי חלון הגולגולת.
- הכנות כלליות
- ודא כי ההליך מאושר על ידי הנחיות המוסד המקומי לרווחת בעלי חיים לפני תחילת העבודה.
הערה: במחקר זה נעשה שימוש בנקבות עכברי NSG בנות 5 חודשים (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) (n = 5). - לפני הניתוח, autoclave כל כלי ניתוח ולוודא כי כל האספקה הדרושה זמינים. הדפס את רשומות ההרדמה והניתוח.
- יש לוודא כי עם הגעתם, לבעלי החיים יש לפחות שבוע אחד של התאקלמות בחדר גידול בעלי החיים כדי להפחית מצוקה נוספת לאחר הניתוח.
- ביום הניתוח יש לוודא שכל המכשירים (מיקרוסקופ, כרית חימום, מעקר, מקדחה, ואקום וכו') מוכנים לשימוש. ודא שמכונת ההרדמה מכילה מספיק איזופלורן ומלא מחדש במידת הצורך. עבור משתמשים חדשים, הליך חלון הגולגולת יכול להימשך עד 2 שעות לכל חיה; לכן, יש מספיק isoflurane הוא חיוני.
- מניחים את חלונות הזכוכית ואת מוטות הראש באלכוהול ומכינים מיכל עם מלוחים. זה יבטיח זרימת עבודה חלקה ללא הפרות משמעותיות בסטריליות וישמור על זמן ההרדמה עבור כל בעל חיים קצר ככל האפשר.
- פתח את כל חומרי הניתוח על משטח סטרילי בעמדת העבודה. לדוגמה, החלק הפנימי של אריזת גזה סטרילית יכול לשמש למטרה זו. השתמש בטכניקת הטיפים בלבד. כאשר לא משתמשים בכלי ניתוח, מניחים את הקצוות על משטח סטרילי, כגון החלק הפנימי של האריזה של גזה סטרילית.
- בעת ביצוע ניתוחים מרובים, הניחו את כל כלי הניתוח במעקר בין הניתוחים לחיטוים. בעת ביצוע ניתוחים על יותר מ 5 בעלי חיים, להשתמש קבוצה חדשה של מכשירים autoclaved. החלף את קצה המקדחה כאשר הוא הופך להיות קהה עבור אחד חדש כדי למנוע טראומה רקמות.
- ודא כי ההליך מאושר על ידי הנחיות המוסד המקומי לרווחת בעלי חיים לפני תחילת העבודה.
- הרדמה והכנות לניתוח
הערה: מערך ההרדמה זהה לניתוח, כמו גם להדמיה.- מרדימים את העכבר באמצעות איזופלורן (3%-5% לזירוז) בתא הרדמה. לאחר הבטחת עומק הרדמה הולם על ידי בדיקת רפלקס משיכת הדוושה (צביטת כרית כף הרגל בשתי כפות הרגליים האחוריות), העבירו את בעל החיים לתחנת עבודה להכנה. יש לשמור על הרדמה מעל חרוט האף (1%-2%). כאן, להחיל משחת עיניים כדי למנוע נזק הקרנית. באופן קבוע לשלוט על אובדן רפלקסים במהלך הניתוח על ידי בדיקת רפלקס הכפה.
- אם נדרש זיהוי כלשהו של בעל החיים, השתמש בכלי ניקוב אוזניים או מספריים כדי לסמן את האוזניים או השתמש בטוש כדי לסמן את הזנב.
- הסר את הפרווה המכסה את הגולגולת בין האוזניים והעיניים עם קרם depilatory. השאירו את הקרם כל עוד צוין (30-60 שניות) על ידי היצרן כדי למנוע גירוי בעור. יש לוודא שהקרם בא במגע עם שורשי השיער על ידי מריחה כנגד כיוון צמיחת השיער. הימנע כי קרם depilatory בא במגע עם העיניים. הסירו את שאריות הקרם והשיער על ידי ניקוי האזור במי מלח. לחלופין, השתמש בקוצצים.
- כדי למנוע כאב, זיהום או נפיחות תוך ואחרי הניתוח, יש לתת תרופות נוגדות דלקת לא סטרואידיות (NSAIDs), אופיואידים, חומרים אנטי דלקתיים ואנטיביוטיקה. מתן קרפרופן (5-20 מ"ג/ק"ג, תת-עורי [SQ]), בופרנורפין - שחרור מושהה (1 מ"ג/ק"ג SQ), צפזולין (20 מ"ג/ק"ג SQ) ודקסמטזון (0.2 מ"ג/ק"ג SQ) לפני הניתוח. יש לתת כ-0.3 מ"ל של 0.9% SQ מלוחים כדי למנוע התייבשות.
- לאחר מכן, לקרצף את האזור על ידי ספוג לסירוגין פובידון-יוד ואלכוהול איזופרופיל שלוש פעמים בתנועות סיבוביות ממרכז הגולגולת לפריפריה.
- הליך קרניוטומיה
- העבר את בעל החיים לשולחן הניתוחים והנח אותו בשכיבה גחונית על כרית חימום (~ 37 ° C) כדי להבטיח תנאים איזותרמיים במהלך ההליך. היפותרמיה במכרסמים מפחיתה באופן משמעותי את שיעורי ההישרדות ומאריכה את שלב ההתאוששות שלאחר הניתוח.
- הניחו את הראש במסגרת הסטריאוטקטית על ידי מיקום מוטות האוזניים והחותכות. עבור מוטות האוזן, מצא את הקשת הזיגומטית והכנס את הסורגים מאחורי הקשתות. התחל על ידי אבטחת המוט הנגדי ביד הדומיננטית (למשל, אבטח את המוט השמאלי ביד ימין אם אתה ימני) ולאחר מכן אבטח את הצד הנגדי. כוונן את מיקום האוזן ומוטות החותכות על ידי סיבוב הברגים במידת הצורך.
- יש למרוח שוב משחת עיניים במידת הצורך, ולהשתמש בחתיכת רדיד אלומיניום כדי לכסות את העיניים. זה ימנע כל נזק שנגרם על ידי אור המיקרוסקופ הבהיר ואור UV המשמש לריפוי דבק ציאנואקרילט מאוחר יותר (שלב 2.5).
- לפני החתך, בדוק שוב את רפלקס צביטת הבוהן; במידת הצורך, התאימו את ההרדמה בהתאם. חבר את בעל החיים למכשיר ניטור ההרדמה על ידי מיקום החיישן על הכף האחורית. מדידת קצב הלב וריכוז החמצן בדם תסייע להפחית את התמותה ולשפר את ההתאוששות לאחר הניתוח. בנוסף, לרכוש את קצב הנשימה על ידי בדיקה חזותית של תנועת החזה.
- לכסות את הגוף של החיה עם וילון כדי למנוע היפותרמיה וזיהום. בצע מקלון פובידון-יוד אחרון לפני תחילת הניתוח.
- לבשו כפפות ומעיל מעבדה נקי.
הערה: מומלץ להשתמש בכפפות סטריליות בשל הפולשנות של ההליך וכדי להפחית את הסיכון לכל זיהום ודלקת לאחר הניתוח וכתוצאה מכך תחלואה ואובדן איכות התמונה ב- 2P-IVM (סעיף 5). - הרימו את העור על הגולגולת וצרו חתך על ידי החזקת המספריים בין עין ימין לאוזן וחיתוך לכיוון צד שמאל של הגולגולת בעקבות סימני החתך. הסר את דש העור העגול שנוצר.
הערה: בהתאם לאזור העניין במוח ולגודל החלון, אתר החתך וקוטרו עשויים להשתנות. גודל החתך צריך להיות גדול מקוטר הראש כדי להכיל מקום להרכבה (שלב 2.5). במידת הצורך, ניתן לנתח בעדינות את העור סביב החתך כדי ליצור יותר מקום. - הסר את periosteum על ידי גירוד עדין את פני הגולגולת עם להב אזמל או microcurrette. היזהר בעת הסרת periosteum סביב התפרים הגולגולתיים מאז אזורים אלה שבירים נוטים יותר לדימום. השתמשו במי מלח ובוואקום כדי לשמור על אזור הניתוח נקי מלכלוך. לגרד את periosteum כדי להבטיח היצמדות טובה יותר דבק cyanoacrylate מלט שיניים (שלב 2.5)
- זהה את האזור במוח לביצוע הזרקת התא. לשם כך, השתמש באטלס של הקואורדינטות הסטריאוטקטיות של מוח העכבר. בהתאם לקואורדינטות המוח, סמן את מיקום חלון הגולגולת באמצעות ניקוב ביופסיה באותו קוטר כמו החלון, עט כירורגי או עיפרון אוטוקלב.
- החזיקו את המקדחה ביד הדומיננטית וכל מכשיר אחר (מזרק, מלקחיים) ביד הלא דומיננטית. הימנעו מקידוח ממושך באותה נקודה. יש להשתמש במקדחה בפרצים כדי למנוע התחממות יתר. במהלך הפסקות אלה, יש למרוח מי מלח קרים על הקלבריום כדי לשמור על הנוף הניתוחי נקי ולמנוע התחממות יתר. השתמש במשוב החושי מקצה המקדחה כדי לזהות מתי הגולגולת נוקבה לחלוטין.
- השתמש מלוחים קרים, בשילוב עם ואקום, כדי לנקות את פני הגולגולת. אין להשתמש בגזה או במוליך קצה כותנה לאחר פתיחת הקלבריום, שכן שאריות של חוטי כותנה עלולות להוביל לתגובת גוף זר בעת אטימת חלון המוח.
- בזמן הקידוח, יש לוודא שהמסלול והקוטר זהים בגודלם לאלה של כיסוי הזכוכית. עשו זאת על ידי מיקום מכסה הזכוכית על גבי הגולגולת ואישור כי כיסוי הזכוכית יתאים בדיוק לתוך חלון הגולגולת.
- ברגע שאפשר ללחוץ על דש הגולגולת על-ידי לחיצה עדינה עליו, השתמשו במלקחיים כדי להסיר בזהירות את השבר משדה הניתוח (איור 1B, משמאל). אם עדיין לא ניתן לדכא את הגולגולת, המשיכו לקדוח באזורים של חלון הגולגולת שעדיין מחוברים לשאר הגולגולת ובצעו הערכה מחדש.
- אם מתרחש דימום קל, יש להשתמש בספוג המוסטטי בשילוב לחץ קל או לחילופין, במי מלח קרים כקרח, כדי לסייע בהפחתת איבוד הדם.
- השתלת תאים
- הכינו וספרו את התאים שיושתלו כמתואר (שלב 1.7). ודא שמספר התא הוא 200,000 תאים/μL.
הערה: מומלץ להשהות את התאים במטריצת ממברנה המתמצקת ב- RT. זה ישפר את שיעור ההצלחה של תאים מושתלים בפרנכימה במוח. - מעבירים את התאים במיכל עם קרח לחדר הניתוח. השתמש מזרק microliter אטום גז. לפני השאיפה, לשמור את המזרק על קרח כדי למנוע הבדלי טמפרטורה.
- לאחר שאיפה של 1 μL, מקם את המזרק בתוך המסגרת הסטריאוטקטית.
הערה: ניתן להשתמש בהתקן קואורדינטות סטריאוטקטי אוטומטי המציג את המיקומים בצירי X, Y ו- Z כדי לחסוך זמן. ניתן גם לחשב ידנית את המיקומים על בסיס למדא. הזרקה של יותר מ -1.5 μL אינה מומלצת. זה יבטיח שהאזור המוזרק לא יתמלא יתר על המידה, מה שיגרום להשתלה לא מוצלחת, צמיחה מחוץ לפרנכימה במוח או גרורות. - בצע השתלה באזור V2MM (קליפת המוח הראייתית 2, החלק הבינוני) של המוח, המתאים בקירוב מדיאלי לצדדי (M-L): -1.2 עד -1.6 מ"מ, וגבי לגחון (D-V): -2.6 עד -3.5 מ"מ קואורדינטות.
- עבור הדמיה של שני פוטונים (שלב 4.6), השתילו את התאים באזורי המוח השטחיים כך שניתן יהיה לדמיין את מסת הגידול דרך חלון הגולגולת בהמשך. יש להזריק 0.5 μL (100,000 תאים) בחלק הקדמי עד האחורי (A-P): עומק 0.8 מ"מ. הזיזו את המחט לאט, בצורה הדרגתית, כשאתם נכנסים למוח והמתינו 30 שניות לאחר ההזרקה (איור 1B, עמודה אמצעית).
- השתמש באותה גישה בעת משיכת המחט ויציאה מרקמת המוח. הימנע מהזרקה קרוב לחדרים מכיוון שהנוזל השדרתי עלול לעודד גרורות במערכת העצבים המרכזית וההיקפית.
- הכינו וספרו את התאים שיושתלו כמתואר (שלב 1.7). ודא שמספר התא הוא 200,000 תאים/μL.
- סגירת חלון הגולגולת
- העבירו את מוט הראש ואת כיסוי הזכוכית מאלכוהול לתמיסת מלח. השתמש בקצה ואקום או במלקחיים כדי לנווט רכיבים אלה לאתר הניתוח.
- מקמו את מכסה הזכוכית בתוך חלון הגולגולת והניחו כמות קטנה של דבק ציאנואקרילט בין הגולגולת למכסה הזכוכית. דבק ציאנואקרילט המופעל על ידי UV מפחית את זמן הריפוי ומונע תזוזה מקרית. אם דבק כלשהו נשפך על מכסה הזכוכית, הסירו אותו עם אפליקטור קצה כותנה או על ידי גירוד עדין עם הצד הקהה של אזמל לפני שהוא מחלים לחלוטין.
אזהרה: אור UV מזיק לעיניים ולעור. הימנע ממגע עיניים ועור בזמן ריפוי הדבק. - לאחר אבטחת מכסה הזכוכית בחלון הגולגולת, יש למרוח את מוט הראש. מערבבים את המלט הדנטלי הדו-רכיבי, מקמים את מוט הראש ומורחים את המלט על האזור שמסביב, תוך הבטחת מגע בין הגולגולת למוט הראש. נקו בזהירות כל מלט מיותר בעזרת קצה מזרק, אזמל או מקדחה.
הערה: מלט דנטלי מתמצק מהר מאוד, ולכן מומלץ ליישם אותו במועד. - לאחר איטום חלון הגולגולת, יש לזהות אם אזורי גולגולת כלשהם בין המלט הדנטלי לעור עדיין חשופים. אם זה המקרה, יש למרוח דבק כירורגי כדי לכסות את הגולגולת על ידי סגירת העור. לחילופין, בצעו תפר בודד עם חומר תפר נספג.
3. התאוששות לאחר ניתוח וצמיחת הגידול
- שחזור
- יש לעקוב אחר בעל החיים על פד מחומם בכלוב התאוששות עד לחזרתו להכרה מלאה. שכן את בעלי החיים בנפרד לאחר הניתוח כדי להפחית את הסיכון לפציעה.
- לנהל דיאטה התאוששות, כגון ג'ל מים זמין מסחרית עם אלקטרוליטים או סוכרים. לחלופין, ספקו צ'או מעבדה סטנדרטי לח כדי להבטיח תזונה קלה ולמנוע התייבשות והיפוגליקמיה.
- ניטור
- עם ההתאוששות, יש לעקוב אחר בעל החיים מדי יום לאיתור סימני כאב, מצוקה או זיהום. במידת הצורך, לתת משככי כאבים, תרופות אנטי דלקתיות, או אנטיביוטיקה. אם בעל חיים מגיע לנקודת הסיום של המחקר, הרדימו אותו באופן הומני. לאחר ההדמיה הסופית, יש להרדים את העכבר על ידי חנק פחמן דו חמצני, ולאחר מכן נקע צוואר הרחם.
הערה: דוגמאות לקריטריונים להמתת חסד מוקדמת כוללות אך אינן מוגבלות לירידה משמעותית במשקל (>20%), הפרעות נוירולוגיות, קוצר נשימה, דימום מוגזם במהלך ניתוח או התנהגות סטריאוטיפית בולטת. בדוק את חלון הגולגולת ונקה אותו עם מי מלח או אלכוהול בעת הצורך. - כדי לעקוב אחר צמיחת הגידול ולתכנן את נקודות הזמן של ההדמיה, בצע הדמיה ביולומינסנציה של כל הגוף (BLI). לשם כך, להזריק 150 מ"ג / ק"ג D-luciferin intraperitoneally ולדמיין את החיה לאחר 5-15 דקות.
- עם ההתאוששות, יש לעקוב אחר בעל החיים מדי יום לאיתור סימני כאב, מצוקה או זיהום. במידת הצורך, לתת משככי כאבים, תרופות אנטי דלקתיות, או אנטיביוטיקה. אם בעל חיים מגיע לנקודת הסיום של המחקר, הרדימו אותו באופן הומני. לאחר ההדמיה הסופית, יש להרדים את העכבר על ידי חנק פחמן דו חמצני, ולאחר מכן נקע צוואר הרחם.
4. סינתזת ננו-חלקיקים
- הכנת חלקיקים
- הוסף 11.17 מ"ל של Ferumoxytol (6 mmol Fe בסך הכל) לתמיסה המכילה 50 מ"ל של 5 M NaOH, 20 מ"ל של מים deionized (מים DI) ו 20 מ"ל של epichlorohydrin. שימו לב להפרדה בשלב זה. יש לדגור על התערובת ב-RT תחת ניעור עדין במשך 24 שעות.
- לאחר 24 שעות, הפתרון הופך אחיד. יש לסלק את עודפי האפיכלורוהידרין באמצעות צינורות דיאליזה (חתך של 12,000-14,000 דא) כנגד מים למשך 3 ימים.
- לאחר הדיאליזה, להעביר את התמיסה שנותרה בצינור לתוך בקבוק זכוכית (נפח כולל ~ 110 מ"ל). מוסיפים 30 מ"ל אמוניה הידרוקסיד, ומערבבים את התערובת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 18-20 שעות.
- לאחר ערבוב, יש לחזור על הדיאליזה כנגד המים במשך 3 ימים. העבירו את התמיסה שנותרה בצינורות הדיאליזה לבקבוק זכוכית חדש בנפח כולל ~110 מ"ל.
- צימוד פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC)
- הוציאו 27.5 מ"ל של חלקיקים פונקציונליים אמין עבור צימוד FITC. רכז את החלקיקים באמצעות מסנן אולטרה-צנטריפוגה 10 kDa ושטוף עם חיץ pH 9 (Na2CO3/NaHCO3) ב 5752 x גרם ב 25 ° C במשך 10 דקות.
- הוסף 4 מ"ל של התמיסה לתוך המסנן אולטרה צנטריפוגה את הצינור ב 5752 x גרם ב 25 ° C במשך 10 דקות. השליכו את התסנין ומלאו מחדש את המסנן במאגר לסבב שני של כביסה באותו פרוטוקול.
- השליכו את התסנין ואספו את התמיסה בפילטר באמצעות פיפט. להעריך את הריכוז המולרי של החלקיק על ידי ריכוז המסה של Ferumoxytol, בהנחה הקוטר של כל חלקיק הוא 5 ננומטר.
- ממיסים את FITC בדימתיל סולפוקסיד נטול מים (DMSO) במינון של 10 מ"ג/מ"ל. הוסף באיטיות 1.4 מ"ל של FITC מומס DMSO לחלקיק המרוכז המתפקד כאמין. היחס המולרי של FITC: חלקיק הוא 20:1. לאחר מכן, לדגור את הפתרון ב 4 ° C במשך 8 שעות בחושך.
- להרוות את התגובה על ידי הוספת עודף NH3. H2O (הריכוז הסופי של NH3. H2O הוא 50 mM), ואז נותן את הפתרון להישאר ב 4 ° C בחושך במשך 2 שעות. שטפו עודפי FITC באמצעות מאגר Na2CO3/NaHCO3 (pH 9) דרך מסנן 10 kDa בטמפרטורה של 5,752 x גרם ב-25°C למשך 10 דקות. ה- pH הסופי של התמיסה מותאם ל -7.4 באמצעות תמיסה מימית HCl.
5. 2P-IVM
הערה: עבור מפגשי 2P-IVM, נעשה שימוש במיקרוסקופ ערבה Ultima IV עם שלב מותאם אישית (איור 2 וקובץ קידוד משלים 1) המאפשר להתאים את מיקום חלון הגולגולת אופקית ואנכית. תוכנת פיג'י שימשה לעיבוד לאחר וניתוח תמונה. בדרך זו, ניתן לכוונן את קרן הלייזר כך שתפגע בזכוכית בזווית של 90 מעלות, תוך הפחתת ממצאים ושיפור איכות ההדמיה.
- מפגש הדמיה
- הפעל את לייזר Ti-Sapphire. הפעל את מתג המערכת הראשי ואת תוכנת Prairie View.
- להרדים את החיה, כמתואר לעיל (שלב 2.2). בצע טיפולי הדמיה במשך עד שעתיים לכל בעל חיים. שמור על זמן הדמיה מינימלי כדי להפחית את הסיכון לסיבוכי הרדמה ותחלואה או תמותה נלווים.
- השתיקו את העכבר מתחת למיקרוסקופ בעל שני פוטונים באמצעות שלב מותאם אישית (איור 1B, עמודה ימנית). הניחו את בעל החיים במצב נוטה על פד מחומם המיועד לניתוחי מכרסמים ואבטחו אותו קלות באמצעות נייר דבק תוך שימת לב לא לכווץ את בית החזה. הניחו טיפת מים על חלון הגולגולת וכווננו את המיקוד.
- לרכוש קצב לב וחמצון דם כדי לפקח על הפרמטרים החיוניים של בעלי החיים. מקם את החיישן על הכף האחורית והשאר את מכשיר הניטור מחוץ לתא הדמיה של שני פוטונים.
- ברגע שהחיה נמצאת על במת המיקרוסקופ, התאימו את תנוחת הראש. בעזרת המשקפת ותאורת הפלורסנט רחבת השדה, קבעו את מסנן החלבון הפלואורסצנטי האדום (RFP) ומצאו את שדה הראייה הרצוי (איור 1B, עמודה ימנית).
- לאחר קביעת כיוון הדגימה ושדה הראייה, העבר את המיקרוסקופ ממצב שדה רחב למצב מיקרוסקופ סריקת אור (LSM).
- ודא שהלייזר Ti-Sapphire נעול במצב של 920 ננומטר, וכל התריסים פתוחים. הבא את גלאי צינור מכפיל האור GaAsP (PMT) מתחים עד 500-600 V. השתמש בשני PMT עם ערכות מסננים עם מעברי פס ב- 595/50 (RFP) ו- 525/50.
- לחץ על Live Image ושנה באיטיות את תא הפוקל כדי להגביר את עוצמת הלייזר בדגימה עד להצגת תמונה.
- לאחר השגת תמונה ברורה, השתמש בתוכנה ובשלב הממונע כדי להגדיר את החלק העליון והתחתון של ערימת תמונות באזור הדגימה הרצוי. היזהרו מגודל המדרגה וקחו בחשבון שציר ה-Z מתאים את עומק העדשה.
- עם עומק הולך וגדל, התמונות יהפכו כהות יותר. הגדל את רווח ה- pockels/PMT לאט כדי לשמור על תמונה בהירה. היזהר לא להשתמש יותר מדי כוח כפי שהוא יכול להוביל phototoxicity נזק רקמות.
- הגדר נתיב שמירה והתחל את סידרת Z. הוא יעבור באופן אוטומטי לעמדות ההתחלה והסיום באמצעות הגדרות pockel/PMT שנקבעו. לאחר השלמת הערימה, השתמש בהפעלה כדי לחפש איכות בערימה. לאחר השלמת רכישת התמונות הדרושות, כבה את הלייזר Ti-Sapphire.
- העבר את בעל החיים לכלוב התאוששות, כמתואר לעיל (שלב 3.1).
- צא מתצוגת הערבה וודא שכל הנתונים נשמרים/מועברים. כבה את המחשב וכבה את כל החומרה.
- עיבוד לאחר עם פיג'י
הערה: פיג'י היא תוכנת קוד פתוח המתמקדת בניתוח תמונה ביולוגית21.- הורד את FIJI ביחס למערכת ההפעלה. חלץ את תוכן התיקיה והפעל את קובץ .exe.
- גרור את קובץ ה- .env שנאסף מההדמיה של שני פוטונים לתיבת הדו-שיח. פצלו את הערוצים לתיבות תמונה שונות. פעולה זו תיצור שתי תמונות שונות עם ערוצים שונים, האחת מכילה את אות התא והשנייה את אות החלקיק.
- העתק את אחת התמונות ולחץ על File > New > Internal Clipboard כדי ליצור תמונה נוספת. שנה את שמה של אחת התמונות כמקור ואת השנייה כהעתק.
- השתמש בתמונת ההעתקה ולחץ על תהליך > שפר את הניגודיות בתיבת הדו-שיח. לחץ על Normalize and OK ולאחר מכן על Process > Smooth. תמונה זו משמשת ליצירת מסיכה ולא לניתוח. לחץ על תמונה > התאם סף > בתיבת הדו-שיח. השתמש/י בסולם ההזזה ובשיטה המתאימה לחילוץ ולאחר מכן לחץ/י על ״החל״.
- השתמשו ב-Process > Binary > Erode כדי לשחוק פיקסלים בודדים ברקע ולחצו על Process > Binary > Dilate כדי להוסיף פיקסלים בחזרה לתמונה.
- לחץ על Process > Image Calculator בתיבת הדו-שיח, בחר את תמונת המקור כראשונה ובחר את התמונה השנייה כהעתק. השתמש ב - AND כדי ליצור את ההצטלבות של שתי התמונות. חזרו על אותו שלב בתמונת הערוץ השני.
- לניתוח אותות מחוץ לאזור כלי הדם, פתח תמונה שהועתקה ללא שינוי ומחק את אזור כלי הדם של האות באמצעות הכלי Freehand ROI.
- הגדר פרמטרים רצויים על ידי מעבר אל נתח > הגדר מדידות. ודא שהאפשרות שטח, צפיפות משולבת וערך אפור ממוצע מסומנים.
- עכשיו לנתח על ידי ניתוח > מידה. חלון עם המידות יופיע. העתק את הנתונים לגיליון אלקטרוני.
- כעת בחרו אזור קטן בתמונה שאין בו פלואורסצנטיות. זה יהיה הרקע.
- לחץ על נתח > מידה עבור אזור זה. העתקת נתונים לגיליון אלקטרוני.
- שמור את התמונה המתקבלת כקובץ > שמירה בשם > ניתוח סוג הקובץ לצורך מדידות מחדש או למטרות פרסום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן, ביצענו ניתוח חלון גולגולתי והשתלנו תאי C6 במודל עכבר NSG של GBM (n = 5). איטום נכון בין כל הרכיבים המעורבים ביצירת החלון (איור 1A) יבטיח את עמידות החלונות להדמיה ארוכת טווח ובנוסף יפחית את התחלואה. באמצעות השלב שהותאם ל-in vivo 2P-IVM (איור 2), יכולנו לדמיין חיות תחת הרדמה במשך עד שעתיים ללא כל חפצי תנועה משמעותיים. כ-10 דקות לאחר יישום תוך ורידי של ננו-חלקיקים בעכברים נושאי GBM, 2P-IVM מראה את האות הירוק, הפלואורסצנטי, של כלי הדם באזור הגידול, בהתאם ללוקליזציה תוך-וסקולרית של ננו-חלקיקים המסומנים בתווית FITC. רק כמות קטנה של אות ירוק-פלואורסצנטי נרשמת מחוץ לכלי הדם, מה שמצביע על תחילת האקסטרווציה של NPs (איור 3A). ניתן לראות עלייה באות FITC שמקורו בחלל החוץ-וסקולרי, אשר עולה בקנה אחד עם אקסטרווסציה מתקדמת (איור 3B).
איור 1. מיקום חלון גולגולת, קרניוטומיה, השתלה והדמיה. (A) חתך רוחב של המיקום האנטומי של חלון גולגולת. מכיוון שמוט הראש נקי ממתכת, ניתן לבצע הדמיית תהודה מגנטית או הדמיית חלקיקים מגנטיים בנוסף למיקרוסקופ תוך-חיוני של שני פוטונים. (B) סקירה כללית (שורה עליונה) ותצוגה מפורטת (שורה תחתונה) של הקרניוטומיה (משמאל), השתלת תאים (באמצע) ומיקרוסקופ תוך-חיוני של 2 פוטונים (מימין). עם פתיחת הגולגולת מתרחש דימום שטחי (משמאל) ונספג מחדש במהירות (באמצע). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. תכנון בעזרת מחשב (CAD) של הבמה. CAD של השלב המשמש למיקרוסקופיה תוך-חיונית של 2 פוטונים in vivo , כולל מוט נשיכה, ייצוב מוט ראש וברגים לכוונון גובה וזווית. ניתן למצוא את קובץ ה- CAD התלת-ממדי בקובץ קידוד משלים 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. תמונות במיקרוסקופ תוך-חיוני של 2 פוטונים in vivo . תמונות שנרכשו (A) 10 דקות ו-(B) 24 שעות לאחר מתן ננו-חלקיקים תוך ורידי. בעוד שתאי GBM פולטים אותות פלואורסצנטיים בספקטרום האדום (משמאל), הננו-חלקיקים ברקמת המוח מוצגים בירוק (מימין). # מציין NPs אקסטרווס, * מציין כלי דם. רק מספר מצומצם של חלקיקים עברו אקסטרווסציה ונראים בקרבת תאי הגידול 10 דקות לאחר מתן NP. שפע של חלקיקים נראה באזור תאי GBM, מה שמרמז על אקסטרווציה 24 שעות לאחר מתן NP. הננו-חלקיקים מורכבים מאיזותיוציאנט פלואורסצאין (FITC) וננו-חלקיקים של תחמוצת ברזל (Ferumoxytol). פסי קנה המידה מייצגים 100 מיקרומטר. קיצורים: 2P-IVM: מיקרוסקופיה תוך-חיונית של 2 פוטונים, RFP: חלבון פלואורסצנטי אדום, GBM: גליובלסטומה, FITC: איזותיוציאנט פלואורסצאין, NP: ננו-חלקיקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
קובץ קידוד משלים 1: קובץ CAD תלת ממדי של השלב. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מציגים שיטה למעקב בזמן אמת in vivo NP באמצעות 2P-IVM דרך חלון גולגולתי כדי להעריך את העברת הגידול של NPs תחמוצת ברזל עם תווית פלואורסצנטית. הטכניקה הכירורגית להליך זה דורשת יד יציבה ומיומנויות כירורגיות ניסיוניות מתקדמות. מומלץ לתרגל שימוש בפגרים או פנטומים לפני שמתקדמים לחוויה חיה של בעלי חיים. כחלופה, Hoeferlin et al. יישמו מקדחה רובוטית כדי להפחית את הנזק התרמי, למזער את השתנות הטכניקה הכירורגית ולתקנן ניתוח22.
גודל החלון מייצג פרמטר קריטי נוסף. חלון גדול יותר יאפשר הדמיה של חלק גדול יותר של הגידול עם 2P-IVM. בספרות תוארו גדלים בין 3-7 מ"מ23. עם זאת, חלונות גדולים יותר אינם יכולים להכיל את עקמומיות המוח, מה שעלול להוביל ללחץ אזורי מוגבר24. כדי להתגבר על האיפוק הזה, מה שנקרא "גולגולת זכוכית" יכול לשמש במקום25. בהשוואה לחלונות זכוכית מסורתיים, שיטה זו משתמשת בזכוכית מעוקלת, המתאימה לעקמומיות המוח ובכך מאפשרת יצירת חלונות גדולים יותר תוך הפחתת לחץ המוקד על קליפת המוח. סוג זה של זכוכית מעוקלת אינו זמין מסחרית, ויש לו רק יישומים מוגבלים ב- 2P-IVM, מכיוון שהמשטח המעוגל גורם לתוצרי השתקפות, ומגביל את שטח החלון שניתן לצלם. חלופה נוספת היא חלון24 מבוסס סיליקון. מצד אחד, שיטה זו מציעה גמישות רבה יותר לגבי גודל וצורת החלון שייווצר. בנוסף, דווחו תוצאות דומות מבחינת כשל בחלונות ושיעורי דלקת לחלונות זכוכית קלאסיים. מצד שני, איכות הדמיה של 2 פוטונים בחלונות מבוססי פולימר הוכחה כיורדת מהר יותר מאשר בחלונות זכוכית, מה שהופך אותה לבלתי ישימה עבור יישומים ארוכי טווח26. חלון גולגולת דליל מייצג חלופה נוספת. למרות היותו פחות פולשני מחלון הזכוכית הקלאסי, הוא אינו מאפשר השתלת תאי GBM באותה טכניקה המתוארת כאן. בנוסף, קשה להשיג עובי גולגולת עקבי, וכתוצאה מכך, זה יכול לגרום לממצאים משמעותיים ב 2P-IVM27.
קו התאים וכמות תאי GBM המושתלים הם שיקולים חשובים אחרים בעת תכנון ציר הזמן של המחקר. קו תאי גליומה של חולדה C6 הוא אחד מקווי התאים הנפוצים ביותר במחקר GBM. בחולדות ובעכברים, מספרי תאים בין 5 x 104 ו 5 x 106 דווחו עבור השתלות תוך גולגולתיות 27,28,29,30,31. ככלל, בעת השתלת מספר גבוה יותר של תאים, יש לצפות לצמיחת גידול מהירה יותר. בפרוטוקול זה הושתלו 1 x 105 תאים וההדמיה בוצעה בימים 11 ו -12 לאחר ההשתלה. Xin et al. השתילו 1 x 105 C6 תאים בעכברים עירומים BALB/c ודיווחו על גילוי GBM מתקדם ב- MRI ביום 7 לאחר ההשתלה ותמותה מוגברת לאחר 15 יום30. לשם השוואה, Jia et al. השתמשו במספר גבוה יותר של תאים (1 x 106) ובאותו זן עכבר וזיהו מסת גידול קטנה ביום 7 ב- MRI עם מחסום דם-מוח משובש מעט (BBB), כפי שהודגם על ידי כתם כחול חיוור של אוונס ברקמת GBM32. ביום ה-14, הכתם הכחול של אוונס היה חזק יותר מאשר ביום ה-7, מה שמצביע על כך שה-BBB היה משובש מאוד. בתורו, הגידול הגידול משפיע גם על כמה זמן בעלי החיים יכולים להישמר בניסוי. זהו שיקול חשוב של רווחת בעלי חיים במחקרי הדמיה אורכיים. חלונות גולגולתיים כרוניים דווחו כמתאימים להדמיה עד 6 חודשים לאחר ההשתלה26.
הננו-חלקיקים המשמשים בפרוטוקול זה מורכבים מתחמוצת ברזל ורכיבים פלואורופוריים. יישומים אפשריים כוללים חקירה של העברת הגידול של תרופות טיפוליות חדשניות, טיפולים תאיים, והתערבויות על כלי הדם של הגידול ומיקרו-סביבה של הגידול. מועמדים שונים לתרופות וטיפולים משולבים ניתנים להערכה ברמה התאית והמולקולרית. רכיב תחמוצת הברזל של NPs מאפשר הדמיה מולטימודאלית עם MRI או דימות חלקיקים מגנטיים בנוסף ל- 2P-IVM. בעוד MRI מייצג שיטת הדמיה רלוונטית מבחינה קלינית, הרזולוציה האנטומית שלו נחותה מזו של מיקרוסקופ תוך חיוני33.
לשיטה זו יש גם מגבלות מסוימות. קואורדינטות המוח על פי אטלס מוח עכבר מתוקננות לעכברי C57BL/6J ויש להתאים אותן בהתאם לזן העכבר, מין וגיל. יתר על כן, עם הדמיה של שני פוטונים, ניתן לגשת רק לעומק מוגבל של כ -450 מיקרומטר9. לכן, אפיון חלקי בלבד של הגידול אפשרי עם 2P-IVM, וניתן להחמיץ הבדלים אזוריים במאפייני הגידול. בנוסף, נכללו רק שתי נקודות זמן לאחר ניהול NP. מחקרים עתידיים, כולל נקודות זמן רבות יותר לאחר מתן תוך ורידי, יאפשרו ניתוח מפורט יותר של ההתנהגות המרחבית-זמנית של NPs במיקרו-סביבה של הגידול.
לסיכום, הערכנו את העברת הגידול של ננו-חלקיקי תחמוצת ברזל עם תווית פלואורסצנטית באמצעות 2P-IVM במודל עכברי של GBM. שיטה זו ניתנת לשינוי בקלות כך שתתאים לתחומי מחקר שונים ומייצגת כלי חשוב לדימות מוחי in vivo בתחום מדעי המוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד עניינים.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לשירות המיקרוסקופיה של מדעי המוח ע"ש סטנפורד וו צאי, למרכז סטנפורד לחידושים בדימות In Vivo (SCi3) - מרכז הדמיה לבעלי חיים קטנים, למענק המכשור המשותף של NIH S10 (S10RR026917-01, PI מייקל מוסלי, Ph.D.) ולמתקן הדימות הפרה-קליני של סטנפורד בפורטר דרייב על אספקת הציוד והתשתית לפרויקט זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם, מענק מספר R01HD103638. ברצוננו להודות לקבוצת שניצר, אוניברסיטת סטנפורד; מעבדת Zuo, אוניברסיטת סנטה קרוז; והמעבדה לדימות נוירו-וסקולרי, המרכז הפוטוני של בוסטון, אוניברסיטת בוסטון, לדיונים חינוכיים על דימות דו-פוטוני ומודלים של חלונות גולגולת.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride infusion solution | Baxter Corp | 533-JB1301P | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium |
Invitrogen | 11965-092 | |
| 1 mL syringes | BD | Luer-Lok syringe, REF309628 | |
| 10% FBS | Thermo fisher | Cytiva SH30910.03HI | |
| 10% DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| 2-photon microscope | Prairie Technologies, Bruker | Prairie Ultima IV | |
| Alcohol applicators, 70% | Medline Industries, LP | MDS093810 | |
| Alcohol, spray bottle | Decon Labs Inc | Decon SaniHol, 04-355-122 | |
| Aluminum foil | Reynold Brands | Reynold Wrap non-stick aluminum foil | |
| Anesthesia machine | Patterson Scientific | SAS3 | |
| Anesthesia monitoring | Kent Scientific | MouseSTAT Jr. Rodent Pulsoxymeter | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x), liquid | Invitrogen | 15240-096 | |
| Betadine applicators | Professional Disposables International, Inc | S41125 | |
| Biopsy punch, 5 mm | Miltex | Size 5 | |
| Buprenorphine sustained release | Zoo Pharm | Bup SR Lab, 1.0 mg/mL | A generic drug can be used instead. |
| C6 rat glioma cell line | ATCC (American Tissue Culture Collection) | CCL-107 | |
| Cannulas | BD | 16 G, 1.1/2”, 30 G, 1” | |
| Carprofen | Pfizer | Rimadyl, 50 mg/ml | A generic drug can be used instead. |
| Cefazoline | Sagent Pharmaceuticals | 25021-101-10, 1 g/vial | A generic drug can be used instead. |
| Cell strainer, 40 µm | Fisher Scientific | 87711 | |
| Cotton tip applicators, 6” | Dyad Medical Sourcing, LLC | HCS1005 | |
| Dental cement | Stoelting Co | 51459 | Dental cement kit, clear, 2 components |
| Dexamethasone | Bimeda | 138RX, 2 mg/mL | A generic drug can be used instead. |
| DietGel | ClearH2O | Recovery, 72-06-502 | |
| Drape | Cardinal Health | Bio Shield Wrap | |
| Drill | Saeyang Microtech | Escort Pro, B08350 | |
| Drill tips | Hager & Meissinger GmbH | REF310104001001005 | Size 005, US 1/4 |
| FIJI imaging analysis software | National Institute of Health | https://imagej.net/software/fiji/ | |
| Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | |
| Gauze | Fisher HealthCare | Sterile Cotton Gauze Pad, 4 x 4”, 22-415-469 | |
| Gelfoam | Ethicon Inc. | Surgifoam absorbable gelatin sponge, Ref. 1972 | |
| Germinator | Cellpoint Scientific | Germinator 500, No. 11688 | |
| Glass coverslips, 5 mm diameter | Fisher Scientific | Menzel Cover glass | |
| Gloves, non-sterile | Fisher Scientific | Nitrile powder-free medical examination gloves | |
| Gloves, sterile | Medline Industries, LP | MDS104070 | |
| Hair removal cream | Church & Dwight | Nair Hair remover lotion | |
| Hamilton syringe | Hamilton Company Inc | Gastight #1701, 10 µL | |
| HBSS without Ca, Mg | Fisher Scientific | PI88284 | |
| Head bar | Hongway | 5 mm inner diameter O-rings | |
| Heating pad | Stoelting Co. | Rodent warmer X2 | |
| Insulin syringes | Exel International Medical Products | 29G x 1/2″ | |
| Iron oxide nanoparticles | Covis Pharma GmbH | Feraheme ferumoxytol injection, 510 mg/17 mL, 59338077501 | |
| Isoflurane | Dechra | 26675-46-7 | |
| Mice | Jackson Laboratories | NSG, Strain 005557 | |
| Microscope (surgery) | Seiler Medical | Seiler IQ Q-100-220 | |
| Nanoparticles | Custom | Iron oxide nanoparticles (Ferumoxytol) labeled with fluorescein isothiocyanate | |
| Ophtalmic ointment | Major pharmaceuticals | Lubrifresh P.M. nighttime ointment, 203964 | |
| Oxygen | Linde Gas & Equipment Inc. | High Pressure Steel K Style Cylinder, 249CF, 2000PSIG, CGA 540 | |
| Plastic cups | Georgia-Pacirif Consumer Products | Dixie Portion Cup, 2 oz., Plastic, Clear, PK2400 | |
| Polyethylene tubing | Braintree Scientific | 50-195-5494 | |
| Scale | Ohaus Corp | CR2200 | |
| Scalpel | Integra Life Sciences Production Corp | Integra Miltex Stainless steel disposable scalpel | |
| Scissors | Fisher Scientific | 13-804-18 | |
| Sealant | Henkel Corp | Loctite 4014 | |
| Single use lab gown | High Tech Conversions | 17-444-081 | |
| Stereotactic frame | Stoelting Co. | Stoelting New Standard TM | |
| Sterile Vacuum Bottle Top Filtration Systems | Fisher Scientific | S2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE | |
| Styrofoam box | N/A | N/A | |
| Surgical gloves | Cardinal Health | 19-163-108 | |
| Surgical glue, 3M Vetbond tissues adhesive | 3M Animal Care Prodcuts | 1469SB | |
| Tail vein cathether | Custom | Consists of two 30 G cannulas connected with sillicone tubing | |
| TrypLE Express (1x), no phenol red | Invitrogen | 12604-039 | |
| Ultraviolett torch | Spring sunshine technology | Consciot |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Wang, Z., McCracken, S., Williams, P. R. Transpupillary two-photon in vivo imaging of the mouse retina. J Vis Exp. 168, 61970 (2021).
- Zhang, K., et al. In vivo two-photon microscopy reveals the contribution of Sox9+ to kidney regeneration in a mouse model with extracellular vesicle treatment. J Biol Chem. 295 (34), 12203 (2020).
- Jang, W. H., et al. Two-photon microscopy of Paneth cells in the small intestine of live mice. Sci Rep. 8 (1), 14174 (2018).
- Ihler, F., Bertlich, M., Weiss, B., Dietzel, S., Canis, M. Two-photon microscopy allows imaging and characterization of cochlear microvasculature in vivo. Biomed Res Int. 2015, 154272 (2015).
- Matsuura, R., et al. Intravital imaging with two-photon microscopy reveals cellular dynamics in the ischeamia-reperfused rat heart. Sci Rep. 8 (1), 15991 (2018).
- Veres, T. Z., et al. Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy. Sci Rep. 7 (1), 694 (2017).
- Zong, W., et al. Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice. Cell. 185 (7), 1240-1256.e30 (2022).
- Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain. eNeuro. 17 (1), (2019).
- Birkner, A., Konnerth, A. Deep two-photon imaging in vivo with a red-shifted calcium indicator. Methods Mol Biol. 1929, 15-26 (1929).
- Busche, M. A. In vivo two-photon calcium imaging of hippocampal neurons in Alzheimer mouse models. Methods Mol Biol. 1750, 341-351 (2018).
- Li, L., et al. A sensitive two-photon probe to selectively detect monoamine oxidase B activity in Parkinson's disease models. Nat Commun. 5, 3276 (2014).
- Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (3), (2013).
- Ricard, C., et al. Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice. Sci Rep. 6, 26381 (2016).
- Soubéran, A., et al. Effects of VEGF blockade on the dynamics of the inflammatory landscape in glioblastoma-bearing mice. J Neuroinflammation. 16 (1), 191 (2019).
- Zhang, W., et al. Real-time vivo reveals specific nanoparticle target binding in a syngeneic glioma mouse model. Nanoscale. 14 (15), 5678-5688 (2022).
- Wartchow, K. M., et al. Treatment with cyclic AMP activators reduces glioblastoma growth and invasion as assessed by two-photon microscopy. Cells. 10 (3), 556 (2021).
- Jiang, L. W., et al. Label-free detection of fibrillar collagen deposition associated with vascular elements in glioblastoma multiforme by using multiphoton microscopy. J Microsc. 265 (2), 207-213 (2017).
- Chen, Z., Ross, J. L., Hambardzumyan, D. Intravital 2-photon imaging reveals distinct morphology and infiltrative properties of glioblastoma-associated macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (28), 14254-14259 (2019).
- Zhang, Y. S., et al. Labeling human mesenchymal stem cells with gold nanocages for in vitro and in vivo tracking by two-photon microscopy and photoacoustic microscopy. Theranostics. 3 (8), 532-543 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hoeferlin, G. F., Menendez, D. M., Krebs, O. K., Capadona, J. R., Shoffstall, A. J. Assessment of thermal damage from robot-drilled craniotomy for cranial window surgery in mice. J Vis Exp. 189, 64188 (2022).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Sci Rep. 6, 27818 (2016).
- Kim, T. H., et al. Long-term optical access to an estimated one million neurons in the live mouse cortex. Cell Rep. 17 (12), 3385-3394 (2016).
- Kılıç, K., et al. Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice. Front Physiol. 11, 612678 (2021).
- Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. Analysis of optical properties of the mouse cranium-implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 178 (2), 316-322 (2009).
- Lu, W., Sun, Q., Wan, J., She, Z., Jiang, X. G. Cationic albumin-conjugated pegylated nanoparticles allow gene delivery into brain tumors via intravenous administration. Cancer Res. 66 (24), 11878-11887 (2006).
- Zhang, B., et al. LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma. Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).
- Xin, H., et al. Enhanced anti-glioblastoma efficacy by PTX-loaded PEGylated poly(ɛ-caprolactone) nanoparticles: In vitro and in vivo evaluation. Int J Pharm. 402 (1-2), 238-247 (2010).
- Valable, S., et al. In vivo MRI tracking of exogenous monocytes/macrophages targeting brain tumors in a rat model of glioma. Neuroimage. 40 (2), 972 (2008).
- Jia, Y., et al. Phototheranostics: Active targeting of orthotopic glioma using biomimetic proteolipid nanoparticles. ACS Nano. 13 (1), 386-398 (2021).
- Asan, L., et al. Cellular correlates of gray matter volume changes in magnetic resonance morphometry identified by two-photon microscopy. Sci Rep. 11, 4234 (2021).
