Summary
マウスモデルにおける膠芽腫への蛍光標識酸化鉄ナノ粒子の腫瘍送達の2光子顕微鏡法の新しいアプローチを紹介します。
Abstract
脳腫瘍に対する静脈内投与されたがん治療薬の送達は、血液脳関門によって制限される。 in vivo における脳腫瘍における高分子の蓄積と分布を直接画像化する方法は、前臨床モデルにおける薬物送達を理解し、最適化する能力を大幅に向上させるでしょう。このプロトコルはglioblastoma (GBM)のマウス モデルの2光子のintravital顕微鏡検査(2P-IVM)の静脈内投与された蛍光標識されたnanoparticlesの生体 内の 追跡のための実時間方法を説明する。
プロトコルには、実験動物の麻酔と鎮痛、頭蓋窓の作成、GBM細胞の移植、ヘッドバーの配置、2P-IVM研究の実施、長期フォローアップ研究のための術後ケアなど、手順の多段階の説明が含まれています。代表的な2P-IVMイメージングセッションと画像解析を示し、この技術の長所と短所を検討し、潜在的なアプリケーションについて議論します。
この方法は、 in vivo 前臨床脳イメージングの分野におけるさまざまな研究課題に簡単に変更および適応できます。
Introduction
2光子生体内顕微鏡(2P-IVM)は、生体組織1の可視化を可能にする蛍光イメージング技術です。
1990年代に初めて開発された2P-IVMは、網膜2、腎臓3、小腸4、蝸牛5、心臓6、気管7、脳のin vivo解析にさまざまな前臨床モデルで使用されています8,9。神経科学の分野では、2P-IVMは、覚醒動物の健康な脳のリアルタイムイメージング10や、アルツハイマー病11、パーキンソン病12、神経膠芽腫(GBM)13、14、15、16などの神経系疾患の研究技術として重要性を増しています16。
2P-IVMは、膠芽腫の発症中に腫瘍微小環境を研究するための洗練されたソリューションを提供します。以前の研究の中には、in vitro17 と ex vivo モデル18 に焦点を当てたものもあれば、GBM を調べるために in vivo モデル19 と異方性20 を実装したものもあります。Maddenらは、マウスモデル13においてCNS-1ラット神経膠腫細胞株のネイティブイメージングを行った。同所性GL261-DsRedマウスモデルを用いて、Ricardらは、2P-IVM14の腫瘍領域の血管を増強するために蛍光色素の静脈内投与を行った。
ここでは、GBMの同所性マウスモデルにおける蛍光標識酸化鉄ナノ粒子(NP)の腫瘍送達を追跡するために2P-IVMを適用します。この手法では、頭蓋窓を用いて、脳内のNPのリアルタイム時空間分布を詳細に調べることができます。
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Protocol
このプロトコルに記載されている動物手順は、実験動物管理委員会(APLAC)の要件に準拠しています。
1. 細胞培養
- フードの準備
- 手を洗い、手袋と白衣を着用してください。生物学的安全キャビネットの電源を入れ、サッシのレベルを適切な開口部の高さに設定します。フードを3〜5分間パージします。フード部分に70%エタノールをスプレーし、ティッシュペーパーで拭き取ります。
- すべての試薬に70%エタノールをスプレーし、ティッシュペーパーで拭き取ります。試薬をフードに移します。グリルの上に物を置かないでください。フードにこぼれた場合は、ワイプで覆い、70%エタノールをスプレーしてから、もう一度拭いてください。
- 実験後、各アイテムの蓋を慎重に閉め、すべての材料を拭き取り、フードからアイテムをすべて取り外して、元の場所に移します。フードに70%エタノールをスプレーし、拭き取ります。サッシを閉め、生物学的安全キャビネットの電源を切ります。
- 増殖培地の調製
- 50 mLの100%ウシ胎児血清(FBS)を500 mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に加えます。5 mLの抗生物質-抗真菌剤溶液(100x)を追加します。
- すべての試薬を滅菌済みの500 mLろ過ボトル(0.22 μmフィルター)に通します。
- 凍結保存細胞の融解
- 層流フードで、20 mLの増殖培地をT75フラスコに加えます。フラスコに細胞名、日付、継代番号を記載したラベルを付けます。この研究では、接着性C6神経膠腫細胞を使用しました。
- 細胞を37°Cのウォーターバスで迅速に解凍します。セルをボルテックスしないでください。セルを解凍してすぐに使用します。
- 1 mLのピペットチップを使用して、融解した細胞をT75フラスコに移します。移送プロセス中に気泡が発生しないように注意し、フラスコの首に中程度の残留物がないようにしてください。これにより、汚染のリスクが高まる可能性があります。
- メディアの変更
- 融解の翌日に培地を交換して、残留トリプシンまたはジメチルスルホキシド(DMSO)を除去します(ステップ1.6)。その後、細胞のコンフルエントレベルに応じて、少なくとも週に2回以上培地を交換します。培地は、トリプシンを除去するために、継代後1日で交換する必要があります。
- 培地を交換するには、吸引装置の電源を入れ、吸引ガラスピペットを取り付けて、すべての培地を吸引します。
- 20 mLの増殖培地を加えます(ステップ1.2)。
- 細胞の継代
- 実験の過程で必要なアイテムをフードに積み込みます。
- 吸引ガラスピペットを使用し、すべての培地を吸引し、ガラスピペットがフラスコの非細胞側にあることを確認します。このステップでは、T75フラスコを垂直に配置します。
- ~10 mLの室温(RT)リン酸緩衝生理食塩水(PBS、Ca++ 、Mg++ フリー)またはハンクス平衡塩溶液(HBSS、Ca++、 Mg++ フリー)を非細胞側に加えます。細胞側を下にしてT75フラスコを水平に配置し、PBSで細胞を短時間洗浄します。
- すぐにフラスコを垂直に置き、PBS/HBSSを吸引します。この洗浄と吸引を3回繰り返します。
- 細胞側(T75フラスコを水平にし、細胞側を下にして)に2 mLのトリプシン(組換え体または動物由来)を加えます。標準的な組織培養インキュベーター(37°C、5%CO2)で4分間インキュベートします。5 mLのピペットを使用して2分後に1回トリチュレートします。
- 4分間のインキュベーション後、溶液を15 mLのコニカルチューブに移します。8 mLの増殖溶液をコニカルチューブに加えます(トリプシン処理細胞2 mL+培地8 mL=合計10 mL)。
- フィルター付きの別の空の15 mLコニカルチューブを使用し、25 mLピペットを介して細胞を移し、個々の細胞を実現します。
- 溶液(セル+培地+Tryp-LE)の1/10(1 mL)を、培地20 mLの入ったT75フラスコに移します。または、セルをカウントします(ステップ1.7)。翌日、トリプシン以外の培地溶液に培地を交換します。
- 培地と細胞の凍結
- FBS100%を4°Cの冷蔵庫で解凍します。水浴や加熱はFBSのタンパク質を損傷する可能性があるため、使用しないでください。
- 50 mLの凍結培地を調製するには、45 mLのDMEM、5 mLのFBS、および5 mLのDMSOを混合します。断続的な解凍やタンパク質の損傷を防ぐために、1〜2 mLの容器に分注します。-20°または-80°Cの冷凍庫に保管してください。
- 残りの9 mLの溶液(ステップ1.5)について、1 mLの培地を加えて合計10 mLにします。300 x g で4分間遠心分離します。
- 上清を除去し、1 mLの凍結培地に再懸濁します(上記参照)。細胞を-80°Cの冷凍庫の凍結容器に入れます。細胞を液体N2 に移し、1〜2日後に長期保存します。
- セルを数える
- 残りの 9 mL (ステップ 1.5) については、1 mL の培地を添加して合計 10 mL にします。300 x g で4分間遠心分離します。
- 上清を除去し、4 mLのHBSSに再懸濁します。10 μLの細胞を80 μLのHBSS + 10 μLの0.4%トリパンブルー(希釈係数 = 10)に再懸濁します。
- 17 μLの溶液を採取し、血球計算盤で4 x 4の正方形を4つ数えます。4 つの 4 x 4 の正方形の平均カウントに 104x 希釈係数を掛けて、細胞/mL を求めます。
2.手術
注:手術は2人の研究者が行うことが推奨されており、1人は細胞の準備、歯科用セメントの混合、および一般的な手順の支援を担当し、2人目は無菌状態を維持することに集中します。外科的処置を支援する2番目のマニピュレーターを持つことで、汚染が発生する可能性が大幅に減少します。最良の外科的慣行に従うことで、術後の合併症の可能性を減らすことができます。 図1A は、頭蓋窓の構成要素の概要を示す。
- 一般的な準備
- 開始する前に、手順が地域の動物福祉機関のガイドラインによって承認されていることを確認してください。
注:この研究では、生後5か月の雌のNSGマウス(NOD.Cg-Prkdcscid il2rgtm1Wjl/SzJ) (n = 5) です。 - 手術前に、すべての手術器具をオートクレーブし、必要なすべての備品が揃っていることを確認してください。麻酔と手術の記録を印刷します。
- 到着時に、動物が少なくとも1週間は畜産室に順応し、術後の苦痛を軽減するようにしてください。
- 手術当日は、すべての機器(顕微鏡、温熱パッド、滅菌器、ドリル、掃除機など)がすぐに使用できる状態であることを確認してください。麻酔器に十分なイソフルランが含まれていることを確認し、必要に応じて補充します。新規ユーザーの場合、頭蓋窓の手順には動物あたり最大2時間かかる場合があります。したがって、十分なイソフルランを摂取することが重要です。
- ガラス窓とヘッドバーをアルコールに置き、生理食塩水の入った容器を準備します。これにより、無菌状態を大きく損なうことなくスムーズなワークフローを確保し、各動物の麻酔時間を可能な限り短くすることができます。
- 作業ステーションの滅菌面ですべての手術材料を開きます。例えば、滅菌ガーゼ包装の内側をこの目的に用いることができる。チップのみの手法を使用します。手術器具を使用しないときは、滅菌ガーゼのパッケージの内側など、滅菌面にチップを置きます。
- 複数回の手術を行う場合は、手術の合間にすべての手術器具を滅菌器に入れて消毒してください。5匹以上の動物に手術を行う場合は、新しいオートクレーブ滅菌器具を使用してください。ドリルの先端が鈍くなったら、組織の外傷を防ぐために新しいものに交換してください。
- 開始する前に、手順が地域の動物福祉機関のガイドラインによって承認されていることを確認してください。
- 麻酔と手術の準備
注:麻酔の設定は、手術とイメージングで同じです。- 麻酔チャンバーでイソフルラン(誘導の場合は3%〜5%)を使用してマウスを麻酔します。.ペダル離脱反射(両後ろ足のフットパッドをつまむ)をテストして適切な麻酔深度を確保した後、動物を準備作業ステーションに移します。鼻錐の上で麻酔を維持します(1%-2%)。.ここでは、角膜の損傷を防ぐために眼軟膏を塗ります。足の反射をチェックすることにより、手術中の反射神経の喪失を定期的に制御します。
- 動物の識別が必要な場合は、イヤーパンチツールまたはハサミを使用して耳に印を付けるか、マーカーを使用して尾に印を付けます。
- 耳と目の間の頭蓋骨を覆っている毛皮を脱毛クリームで取り除きます。皮膚の炎症を避けるために、メーカーが指示する限り(30〜60秒)クリームを放置してください。クリームを髪の成長方向に逆らって塗布することにより、クリームが毛根に接触することを確認してください。脱毛クリームが目に触れないようにしてください。生理食塩水でその部分をきれいにして、クリームや髪の毛の残りを取り除きます。または、バリカンを使用します。
- 術中および術後の痛み、感染症、腫れを避けるために、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)、オピオイド、抗炎症剤、抗生物質を投与します。手術前にカルプロフェン(5-20 mg / kg、皮下[SQ])、ブプレノルフィン-徐放性(1 mg / kg SQ)、セファゾリン(20 mg / kg SQ)、およびデキサメタゾン(0.2 mg / kg SQ)を投与します。.脱水症状を避けるために、約0.3 mLの0.9%生理食塩水SQを投与します。.
- 続いて、頭蓋骨の中央から周辺に向かって円を描くようにポビドンヨードとイソプロピルアルコールを交互に3回綿棒で拭き取ります。
- 開頭手術
- 動物を手術台に移し、加熱パッド(~37°C)の上に腹側横臥に置き、処置中の等温条件を確保します。げっ歯類の低体温症は生存率を著しく低下させ、術後の回復期を延長します。
- 耳棒と切歯棒を配置して、頭を定位フレームに配置します。イヤーバーの場合は、頬骨弓を見つけて、アーチの後ろにバーを挿入します。利き手で反対側のバーを固定することから始めて(たとえば、右利きの場合は左のバーを右手で固定します)、次に反対側を固定します。必要に応じてネジを回して、耳と切歯の位置を調整します。
- 必要に応じて眼軟膏を塗り直し、アルミホイルで目を覆います。これにより、後でシアノアクリレート接着剤を硬化させるために使用される明るい顕微鏡光とUV光によって引き起こされる損傷を防ぐことができます(ステップ2.5)。
- 切開する前に、つま先のつまみ反射をもう一度確認してください。必要に応じて、それに応じて麻酔を調整します。センサーを後足に配置して、動物を麻酔監視装置に接続します。心拍数と血中酸素濃度を測定することは、死亡率を減らし、術後の回復を改善するのに役立ちます。さらに、胸の動きを目視で検査することにより、呼吸数を取得します。
- 低体温症や汚染を避けるために、動物の体をドレープで覆います。手術を開始する前に、最後のポビドンヨード綿棒を1回実行します。
- 手袋と清潔な白衣を着用してください。
注:手術の侵襲性のため、また、術後の感染や炎症のリスクを低減し、2P-IVMの罹患率や画質の低下につながるため、滅菌手袋の使用が推奨されます(セクション5)。 - 頭蓋骨の皮膚を持ち上げ、ハサミを右目と耳の間に挟み、切開痕に従って頭蓋骨の左側に向かって切り込みを入れて切開します。出来上がった丸い皮弁を取り除きます。
注:脳の関心領域と窓のサイズに応じて、切開部位と直径は異なる場合があります。切開のサイズは、取り付け用のスペースを確保するために、ヘッドの直径よりも大きくする必要があります(ステップ2.5)。必要に応じて、切開部の周囲の皮膚を優しく切開して、より多くのスペースを作ることができます。 - メスの刃またはマイクロカレットで頭蓋骨の表面をそっと引っ掻いて骨膜を取り除きます。頭蓋縫合糸の周りの骨膜を除去するときは、これらの領域が壊れやすく、出血しやすいため、注意してください。生理食塩水と真空を使用して、手術部位を破片から清潔に保ちます。骨膜を引っ掻いて、シアノアクリレート接着剤と歯科用セメントへの密着性を高めます(ステップ2.5)
- 細胞注入を行う脳の領域を特定します。このために、マウスの脳の定位座標のアトラスを使用します。脳の座標に従って、窓と同じ直径の生検パンチ、手術用ペン、またはオートクレーブ滅菌した鉛筆を使用して、頭蓋窓の位置をマークします。
- 利き手でドリルを持ち、利き手でない方で他の器具(注射器、鉗子)を持ちます。同じ場所で長時間の掘削は避けてください。ドリルは、過熱を防ぐためにバーストで使用する必要があります。これらの休憩中に、冷たい生理食塩水をふくらはぎに塗布して、手術の視界を清潔に保ち、過熱を防ぎます。ドリルの先端からの感覚フィードバックを使用して、頭蓋骨が完全に穿孔されたことを検出します。
- 冷たい生理食塩水と真空を組み合わせて使用し、頭蓋骨の表面をきれいにします。ふくらはぎを開いた後は、綿糸の残骸が脳の窓を塞いだときに異物反応を引き起こす可能性があるため、ガーゼや綿先アプリケーターを使用しないでください。
- 穴あけ中は、軌道と直径がガラスカバーガラスのカバーガラスと同じサイズであることを確認してください。これを行うには、ガラスのカバーガラスを頭蓋骨の上に置き、ガラスのカバーガラスが頭蓋窓の内側に正確に収まることを確認します。
- 頭蓋骨フラップを軽く押して押し下げることができたら、鉗子を使用して術野から破片を慎重に取り除きます(図1B、左)。頭蓋骨をまだ押し下げることが不可能な場合は、頭蓋骨の残りの部分とまだつながっている頭蓋窓の領域に穴を開け続け、再評価します。
- 少量の出血が発生した場合は、止血スポンジと光圧または氷冷した生理食塩水を組み合わせて使用し、失血を減らします。
- 細胞移植
- (ステップ1.7)に記載されているように、移植する細胞を準備し、カウントします。細胞数が200,000細胞/μLであることを確認してください。
注:RTで固化するメンブレンマトリックス中の細胞を懸濁させることをお勧めします。これにより、脳実質に移植された細胞の成功率が向上します。 - 氷の入った容器に入れた細胞を手術室に移します。気密マイクロリットルシリンジを使用してください。吸引する前に、温度差を避けるためにシリンジを氷上に保管してください。
- 1 μL を吸引した後、シリンジを定位フレーム内に配置します。
注意: X、Y、Z軸の位置を示す自動定位座標デバイスを使用して、時間を節約できます。ラムダに基づいて位置を手動で計算することもできます。1.5 μLを超える注入は推奨されません。これにより、注入された領域が過剰に充填され、移植の失敗、脳実質の外側の成長、または転移が起こらないようにします。 - 脳のV2MM領域(視覚野2、中内側部分)に移植を行い、ほぼ内側から外側(M-L):-1.2〜-1.6 mm、背側〜腹側(D-V):-2.6〜-3.5 mmの座標に対応します。
- 2光子イメージング(ステップ4.6)では、細胞を脳表在領域に移植して、後で頭蓋窓から腫瘍塊を視覚化できるようにします。0.5 μL(100,000細胞)を前方から後方(A-P):0.8 mmの深さに注入します。脳に入るときは、針をゆっくりと段階的に動かし、注射後30秒待ちます(図1B、中央の列)。
- 針を引っ込めて脳組織から出るときも同じ方法を使用します。脳脊髄液は中枢神経系および末梢神経系への転移を促進する可能性があるため、心室近くへの注射は避けてください。
- (ステップ1.7)に記載されているように、移植する細胞を準備し、カウントします。細胞数が200,000細胞/μLであることを確認してください。
- 頭蓋窓の閉鎖
- ヘッドバーとガラスカバーガラスをアルコールから生理食塩水に移動します。バキュームチップまたは鉗子を使用して、これらのコンポーネントを手術部位にナビゲートします。
- ガラスカバーガラスを頭蓋窓の内側に配置し、頭蓋骨とガラスカバーガラスの間に少量のシアノアクリレート接着剤を配置します。UV活性化シアノアクリレート接着剤は、硬化時間を短縮し、偶発的な変位を防ぎます。ガラスのカバーガラスに接着剤がこぼれた場合は、完全に硬化する前に、綿の先端アプリケーターを使用するか、メスの鈍い面でそっと引っ掻いて取り除きます。
注意: 紫外線は目や皮膚に有害です。接着剤を硬化させる間は、目や皮膚に触れないようにしてください。 - ガラスカバーガラスを頭蓋窓に固定した後、ヘッドバーを取り付けます。2液型歯科用セメントを混合し、ヘッドバーを配置し、周囲にセメントを塗布し、頭蓋骨とヘッドバーが確実に接触するようにします。シリンジ、メス、またはドリルチップの先端で余分なセメントを慎重に洗浄します。
注:歯科用セメントは非常に急速に固まるため、タイムリーに適用することをお勧めします。 - 頭蓋窓を密閉した後、歯科用セメントと皮膚の間の頭蓋骨領域がまだ露出しているかどうかを確認します。その場合は、外科用接着剤を塗布して、皮膚を閉じて頭蓋骨を覆います。あるいは、吸収性縫合材料で単一の縫合を行う。
3.術後の回復と腫瘍の増殖
- 回復
- 動物が完全な意識を取り戻すまで、回復ケージ内の加熱パッドで動物を監視します。怪我のリスクを減らすために、手術後に動物を別々に収容します。
- 電解質や糖分を含む市販の水ジェルなどの回復食を投与します。または、湿らせた標準的なラボチャウを供給して、栄養を容易にし、脱水症状や低血糖症を回避します。
- モニタリング
- 回復したら、痛み、苦痛、または感染の兆候がないか動物を毎日監視します。必要に応じて、鎮痛薬、抗炎症薬、または抗生物質を投与します。動物が研究エンドポイントに達した場合は、人道的に安楽死させます。最後のイメージングセッションに続いて、二酸化炭素窒息によってマウスを安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼させます。
注:早期安楽死の基準の例には、大幅な体重減少(>20%)、神経障害、呼吸困難、手術中の過度の出血、または顕著なステレオタイプ行動が含まれますが、これらに限定されません。頭蓋窓を検査し、必要に応じて生理食塩水またはアルコールで洗浄します。 - 腫瘍の成長を追跡し、イメージングの時点を計画するには、全身生物発光イメージング(BLI)を実施します。このために、150 mg / kgのD-ルシフェリンを腹腔内に注射し、5〜15分後に動物を画像化します。
- 回復したら、痛み、苦痛、または感染の兆候がないか動物を毎日監視します。必要に応じて、鎮痛薬、抗炎症薬、または抗生物質を投与します。動物が研究エンドポイントに達した場合は、人道的に安楽死させます。最後のイメージングセッションに続いて、二酸化炭素窒息によってマウスを安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼させます。
4. ナノ粒子合成
- 粒子の調製
- 50 mLの5 M NaOH、20 mLの脱イオン水(脱イオン水)、20 mLのエピクロルヒドリンを含む溶液に、11.17 mLのフェルモキシトール(合計6 mmol Fe)を加えます。この段階で相偏析を観察します。混合物を室温で穏やかに振とう下で24時間インキュベートします。
- 24時間後、溶液は均一になります。透析チューブ(12,000-14,000 Daカットオフ)を使用して、水に対して3日間余分なエピクロルヒドリンを除去します。
- 透析後、チューブ内に残った溶液をガラス瓶(総量~110mL)に移します。30 mLの水酸化アンモニアを加え、37°Cで18〜20時間撹拌します。
- 撹拌後、水に対して透析を3日間繰り返す。透析チューブに残っている溶液を、総容量~110 mLの新しいガラス瓶に移します。
- フルオレセインイソチオシアネート(FITC)コンジュゲーション
- FITC結合のために27.5 mLのアミン官能基化粒子を取り出します。10 kDaの超遠心分離フィルターを使用して粒子を濃縮し、pH 9(Na2CO3/NaHCO3)バッファーで5752 x g 、25°Cで10分間洗浄します。
- 4 mLの溶液をフィルターに加え、チューブを5752 x g 、25°C、10分間超遠心分離します。濾液を廃棄し、フィルターにバッファーを補充して、同じプロトコルで2回目の洗浄を行います。
- 濾液を捨て、ピペットを使用して溶液をフィルターに集めます。各粒子の直径を5 nmと仮定して、Ferumoxytolの質量濃度によって粒子のモル濃度を推定します。
- FITCを無水ジメチルスルホキシド(DMSO)に10 mg/mLで溶解します。1.4 mLのDMSO溶解FITCを濃縮アミン官能基化粒子にゆっくりと添加します。FITCのモル比:粒子は20:1です。その後、溶液を4°Cで暗所で8時間インキュベートします。
- 過剰なNH3を添加して反応をクエンチします。H2O(NH3の最終濃度。H2Oは50 mM)、次いで溶液を暗所で4°Cに2時間とどまらせる。Na2CO3/NaHCO3 (pH 9)緩衝液を10 kDaフィルターに通し、5752 x g 、25°C、10分間、余分なFITCを洗い流します。溶液の最終pHは、HCl水溶液を使用して7.4に調整されます。
5. 2P-IVMの
注:2P-IVMセッションでは、頭蓋窓の位置を水平および垂直に調整できるカスタムステージ(図2 および 補足コーディングファイル1)を備えたPrairie Ultima IV顕微鏡を使用しました。フィジーのソフトウェアは、後処理と画像解析に使用されました。このようにして、レーザービームを90°の角度でガラスに当たるように調整できるため、アーチファクトが減少し、画像品質が向上します。
- イメージングセッション
- Ti-Sapphireレーザーをオンにします。メインシステムスイッチとPrairie Viewソフトウェアの電源を入れます。
- 上記のように動物に麻酔をかけます(ステップ2.2)。動物ごとに最大2時間のイメージングセッションを実行します。麻酔の合併症やそれに伴う罹患率や死亡率のリスクを減らすために、イメージング時間を最小限に抑えてください。
- カスタムステージを使用して、2光子顕微鏡の下にマウスを固定します(図1B、右列)。げっ歯類の手術用に設計された加熱パッドの上に動物をうつ伏せの位置に置き、胸部を収縮させないように注意しながらテープを使用して軽く固定します。頭蓋窓に水滴を置き、焦点を調整します。
- 心拍数と血中酸素濃度を取得して、動物のバイタルパラメータを監視します。センサーを後足に配置し、モニタリングデバイスを2光子イメージングチャンバーの外に置いてください。
- 動物が顕微鏡ステージに乗ったら、頭の位置を調整します。双眼鏡と広視野蛍光灯を使用して、赤色蛍光タンパク質(RFP)フィルターをセットし、目的のイメージング視野を見つけます(図1B、右列)。
- サンプルの向きと視野が決まったら、顕微鏡を広視野モードから走査型光顕微鏡モード(LSM)に切り替えます。
- Ti-サファイアレーザーが920nmでモードロックされ、すべてのシャッターが開いていることを確認してください。GaAsP光電子増倍管検出器(PMT)の電圧を500〜600Vまで上げ、595/50(RFP)と525/50のバンドパスを持つフィルターセットを備えた2つのPMTを使用します。
- ライブ画像を押し、ポッケルセルをゆっくりと修正して、画像が表示されるまでサンプルのレーザー出力を上げます。
- 鮮明な画像が得られたら、ソフトウェアと電動ステージを使用して、画像スタックの上部と下部を目的のサンプル領域内にセットします。ステップサイズに注意し、Z軸がレンズの奥行きを調整することを考慮に入れてください。
- 奥行きが増すと、画像は暗くなります。ポッケル/PMTゲインをゆっくりと上げて、画像を明るく保ちます。力を入れすぎると、光毒性や組織損傷につながるので注意が必要です。
- 保存パスを設定し、Zシリーズを起動します。設定されたポッケル/PMT設定を使用して、開始位置と終了位置に自動的に移動します。スタックが完成したら、再生を使用してスタックの品質を確認します。必要な画像の取得が完了したら、Ti-Sapphireレーザーをオフにします。
- 上記のように、動物を回収ケージに移します(ステップ3.1)。
- プレーリービューを終了し、すべてのデータが保存/転送されていることを確認します。コンピュータをシャットダウンし、すべてのハードウェアをシャットダウンします。
- FIJIでの後処理
注:フィジーは、生物学的画像分析に焦点を当てたオープンソースソフトウェアです21。- オペレーティングシステムに関してFIJIをダウンロードします。フォルダの内容を解凍し、.exeファイルを実行します。
- 2光子イメージングから収集した.envファイルをダイアログボックスにドラッグします。チャンネルを異なる画像ボックスに分割します。これにより、異なるチャンネルを持つ2つの異なる画像が作成され、1つはセル信号、もう1つはパーティクル信号が含まれます。
- 画像の 1 つをコピーし 、[ファイル] > [新規>内部クリップボード] をクリックして 、別の画像を作成します。イメージの 1 つを 「ソース 」、もう 1 つの名前を 「コピー」に変更します。
- コピー画像を使用して、ダイアログボックスの [処理]> [コントラストの強化]をクリックします。 [Normalize ] と [OK ] をクリックし 、次に Process > Smooth をクリックします。この画像は、分析用ではなく、マスクの作成に使用されます。ダイアログボックスで [画像]>[>しきい値の調整 ]をクリックします。抽出に適したスライディングスケールと方法を使用し、[ 適用]をクリックします。
- 「 >バイナリ処理」>「侵食 」を使用して背景の単一ピクセルを侵食し、「 バイナリ>処理> 拡張」をクリックして画像にピクセルを戻します。
- ダイアログボックスで[ 画像計算>処理 ]をクリックし、ソース画像を1枚目として選択し、2枚目の画像を [コピー]として選択します。 AND を使用して、両方のイメージの共通部分を作成します。他のチャンネル画像についても同じ手順を繰り返します。
- 血管領域外の信号解析では、変更されていないコピー イメージを開き、 フリーハンド ROI ツールを使用して信号の血管領域を削除します。
- [ Analyze] > [Set Measurements] に移動して、必要なパラメーターを設定します。 [Area]、[Integrated Density]、および [ Mean Gray Value ] がオンになっていることを確認します。
- 次に 、[Analyze > Measure] で分析します。測定値のウィンドウがポップアップ表示されます。データをスプレッドシートにコピーします。
- 次に、蛍光を発しない画像の小さな領域を選択します。これが背景になります。
- その地域の [Analyze > Measure ] をクリックします。スプレッドシートにデータをコピーします。
- 結果の画像をファイルとして保存>再測定または公開の目的で [ファイル ] > [解析 ] ファイル タイプとして保存します。
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Representative Results
ここでは、頭蓋窓手術を行い、GBMのNSGマウスモデル(n=5)にC6細胞を生着させました。窓の作成に関与するすべてのコンポーネント(図1A)を適切にシールすることで、長期間のイメージングに対する窓の耐久性が保証され、さらに罹患率が低下します。 in vivo 2P-IVMに適合したステージ(図2)を使用すると、麻酔下で最大2時間、大きなモーションアーチファクトなしで動物を画像化することができました。GBM担持マウスにナノ粒子を静脈内適用してから約10分後、2P-IVMは、FITC標識ナノ粒子の血管内局在と一致する、腫瘍領域の血管の緑色の蛍光シグナルを示します。血管の外側には少量の緑色蛍光シグナルのみが認められ、NPの血管外漏出が始まっていることを示しています(図3A)。血管外腔から発信されるFITCシグナルの増加が見られ、これは血管外漏出の進行と一致しています(図3B)。
図 1.頭蓋窓の配置、開頭術、移植、およびイメージング。 (A)頭蓋窓の解剖学的配置の断面。ヘッドバーはメタルフリーであるため、2光子生体内顕微鏡に加え、磁気共鳴画像法や磁性粒子イメージングを行うことが可能です。(B)開頭手術(左)、細胞移植(中)、2光子生体内顕微鏡(右)の概要(上段)と詳細図(下段)。頭蓋骨を開くと、表在性出血が発生し(左)、すぐに再吸収されます(中央)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図 2.ステージのコンピューター支援設計(CAD)。in vivo 2光子生体内顕微鏡に使用されるステージのCADで、バイトバー、ヘッドバーの安定化、高さと角度を調整するためのネジなどが含まれます。3D CAD ファイルは、補足コーディング ファイル 1 にあります。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図 3. In vivo 2光子生体内顕微鏡画像。 (A)ナノ粒子の静脈内投与の10分後および(B)24時間後に取得した画像。GBM細胞は赤色のスペクトル(左)で蛍光シグナルを発しますが、脳組織のナノ粒子は緑色(右)で可視化されています。 # は血管外漏出NPを示し、 * は血管を示します。限られた数の粒子のみが血管外漏出を受けており、NP投与の10分後に腫瘍細胞の近傍に見られます。膠芽細胞の領域に豊富な粒子が見られ、NP投与後24時間での血管外漏出を示唆しています。ナノ粒子は、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)と酸化鉄ナノ粒子(Ferumoxytol)で構成されています。スケールバーは100μmを表します。略語:2P-IVM:2光子生体内顕微鏡、RFP:赤色蛍光タンパク質、GBM:膠芽腫、FITC:フルオレセインイソチオシアネート、NP:ナノ粒子。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
補足コーディングファイル1:ステージの3D CADファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
頭蓋窓を通る2P-IVMを使用して、蛍光標識酸化鉄NPの腫瘍送達を評価するためのリアルタイムin vivoNP 追跡方法を紹介します。この手術の手術技術には、安定した手と高度な実験的手術技術が必要です。生きた動物の体験に進む前に、死骸やファントムを使って練習することをお勧めします。代替案として、Hoeferlinらは、熱損傷を減らし、手術技術のばらつきを最小限に抑え、手術を標準化するためにロボットドリルを実装しました22。
ウィンドウのサイズは、別の重要なパラメーターを表します。ウィンドウが大きければ大きいほど、2P-IVMで腫瘍のより大きな部分を画像化できる。文献では、3〜7 mmのサイズが記載されている23。しかし、大きな窓は脳の湾曲に対応できず、局所圧の上昇につながる可能性があります24。この制約を克服するために、いわゆる「ガラスの頭蓋骨」を代わりに使用することができます25。従来のガラス窓と比較して、この方法は曲面ガラスを使用して脳の湾曲に対応し、皮質への焦点圧を軽減しながらより大きな窓の作成を可能にします。このタイプの曲面ガラスは市販されておらず、曲面が反射アーチファクトを引き起こし、画像化できる窓の領域が制限されるため、2P-IVMでの用途は限られています。別の代替は、シリコンベースのウィンドウ24である。一方では、この方法では、作成するウィンドウのサイズと形式に関して柔軟性が高まります。さらに、窓の故障と炎症率の点で、従来のガラス窓に匹敵する結果が報告されています。一方、ポリマーベースの窓の2光子イメージング品質は、ガラス窓よりも速く低下することが示されており、長期的なアプリケーションには適していません26。薄くなった頭蓋骨の頭蓋窓は、別の選択肢を表しています。従来のガラス窓よりも侵襲性が低い一方で、ここで説明したのと同じ技術を使用したGBM細胞移植はできません。さらに、一貫した頭蓋骨の厚さを達成することは困難であり、その結果、これは2P−IVM27において重大なアーチファクトを引き起こす可能性がある。
移植される細胞株とGBM細胞の量は、研究タイムラインを計画する際の他の重要な考慮事項です。C6ラット神経膠腫細胞株は、GBM研究で最も広く使用されている細胞株の1つです。ラットおよびマウスでは、頭蓋内移植27,28,29,30,31について、5 x 104および5 x 10 6の間の細胞数が報告されています。原則として、より多くの細胞を移植すると、より速い腫瘍増殖が期待されます。このプロトコルでは、1 x 105細胞を移植し、移植後11日目と12日目にイメージングを行いました。Xinらは、BALB/cヌードマウスに1 x 105 C6細胞を移植し、移植後7日目にMRIで進行性膠芽腫を検出し、15日後に死亡率が上昇したことを報告した30。比較すると、Jiaらは、より多くの細胞数(1 x 106)および同じマウス系統を使用し、7日目にMRIで、わずかに破壊された血液脳関門(BBB)を伴う小さな腫瘍塊を検出した。14日目には、エバンスの青色の染色が7日目よりも強く、BBBが非常に破壊されたことを示しています。次に、腫瘍の成長は、動物を実験にどれだけ長くとどめることができるかにも影響します。これは、縦断的画像研究における動物福祉の重要な考慮事項です。慢性頭蓋窓は、移植後最大6か月間の画像診断に適していると報告されています26。
このプロトコルで使用されるナノ粒子は、酸化鉄と蛍光色素成分で構成されています。考えられるアプリケーションには、新規治療薬の腫瘍送達の調査、細胞治療、および腫瘍血管系および腫瘍微小環境への介入が含まれます。さまざまな薬剤候補や併用療法を細胞レベルや分子レベルで評価することができます。NPの酸化鉄成分は、2P-IVMに加えて、MRIや磁性粒子イメージングによるマルチモーダルイメージングを可能にします。MRIは臨床的に関連する画像診断法であるが、その解剖学的分解能は生体内顕微鏡検査の解剖学的解像度よりも劣っている33。
この方法にも一定の制限があります。マウス脳アトラスによる脳座標は、C57BL/6Jマウスで標準化されており、マウス系統、性別、年齢に応じて調整する必要があります。さらに、2光子イメージングでは、約450μmの限られた深さにしかアクセスできません9。 したがって、2P-IVMでは腫瘍の部分的な特徴付けしかできず、腫瘍の特徴の地域差を見逃す可能性があります。さらに、NP投与後の2つの時点のみを組み入れた。静脈内投与後のより多くの時点を含む将来の研究により、腫瘍微小環境におけるNPの時空間挙動のより詳細な分析が可能になります。
結論として、膠芽腫のマウスモデルにおいて、2P-IVMを用いた蛍光標識酸化鉄ナノ粒子の腫瘍送達を評価しました。この手法は、さまざまな研究分野に合わせて簡単に変更でき、神経科学の分野における in vivo 脳イメージングの重要なツールとなっています。
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Disclosures
著者らは、利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
このプロジェクトに機器とインフラを提供してくださったStanford Wu Tsai Neuroscience Microscopy Service、Stanford Center for Innovations in In Vivo Imaging(SCi3)小動物イメージングセンター、NIH S10 Shared Instrumentation Grant(S10RR026917-01、PI Michael Moseley, Ph.D.)、およびポータードライブのStanford Preclinical Imaging Facilityに感謝します。この研究は、国立成育医療研究所(助成金番号R01HD103638)の助成金によって支援されました。スタンフォード大学のシュニッツァー・グループに感謝します。サンタクルス大学のZuoラボ。ボストン大学ボストンフォトニックセンターの神経血管イメージング研究所では、2光子イメージングと頭蓋窓モデルに関する教育的議論を行いました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride infusion solution | Baxter Corp | 533-JB1301P | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium |
Invitrogen | 11965-092 | |
| 1 mL syringes | BD | Luer-Lok syringe, REF309628 | |
| 10% FBS | Thermo fisher | Cytiva SH30910.03HI | |
| 10% DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| 2-photon microscope | Prairie Technologies, Bruker | Prairie Ultima IV | |
| Alcohol applicators, 70% | Medline Industries, LP | MDS093810 | |
| Alcohol, spray bottle | Decon Labs Inc | Decon SaniHol, 04-355-122 | |
| Aluminum foil | Reynold Brands | Reynold Wrap non-stick aluminum foil | |
| Anesthesia machine | Patterson Scientific | SAS3 | |
| Anesthesia monitoring | Kent Scientific | MouseSTAT Jr. Rodent Pulsoxymeter | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x), liquid | Invitrogen | 15240-096 | |
| Betadine applicators | Professional Disposables International, Inc | S41125 | |
| Biopsy punch, 5 mm | Miltex | Size 5 | |
| Buprenorphine sustained release | Zoo Pharm | Bup SR Lab, 1.0 mg/mL | A generic drug can be used instead. |
| C6 rat glioma cell line | ATCC (American Tissue Culture Collection) | CCL-107 | |
| Cannulas | BD | 16 G, 1.1/2”, 30 G, 1” | |
| Carprofen | Pfizer | Rimadyl, 50 mg/ml | A generic drug can be used instead. |
| Cefazoline | Sagent Pharmaceuticals | 25021-101-10, 1 g/vial | A generic drug can be used instead. |
| Cell strainer, 40 µm | Fisher Scientific | 87711 | |
| Cotton tip applicators, 6” | Dyad Medical Sourcing, LLC | HCS1005 | |
| Dental cement | Stoelting Co | 51459 | Dental cement kit, clear, 2 components |
| Dexamethasone | Bimeda | 138RX, 2 mg/mL | A generic drug can be used instead. |
| DietGel | ClearH2O | Recovery, 72-06-502 | |
| Drape | Cardinal Health | Bio Shield Wrap | |
| Drill | Saeyang Microtech | Escort Pro, B08350 | |
| Drill tips | Hager & Meissinger GmbH | REF310104001001005 | Size 005, US 1/4 |
| FIJI imaging analysis software | National Institute of Health | https://imagej.net/software/fiji/ | |
| Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | |
| Gauze | Fisher HealthCare | Sterile Cotton Gauze Pad, 4 x 4”, 22-415-469 | |
| Gelfoam | Ethicon Inc. | Surgifoam absorbable gelatin sponge, Ref. 1972 | |
| Germinator | Cellpoint Scientific | Germinator 500, No. 11688 | |
| Glass coverslips, 5 mm diameter | Fisher Scientific | Menzel Cover glass | |
| Gloves, non-sterile | Fisher Scientific | Nitrile powder-free medical examination gloves | |
| Gloves, sterile | Medline Industries, LP | MDS104070 | |
| Hair removal cream | Church & Dwight | Nair Hair remover lotion | |
| Hamilton syringe | Hamilton Company Inc | Gastight #1701, 10 µL | |
| HBSS without Ca, Mg | Fisher Scientific | PI88284 | |
| Head bar | Hongway | 5 mm inner diameter O-rings | |
| Heating pad | Stoelting Co. | Rodent warmer X2 | |
| Insulin syringes | Exel International Medical Products | 29G x 1/2″ | |
| Iron oxide nanoparticles | Covis Pharma GmbH | Feraheme ferumoxytol injection, 510 mg/17 mL, 59338077501 | |
| Isoflurane | Dechra | 26675-46-7 | |
| Mice | Jackson Laboratories | NSG, Strain 005557 | |
| Microscope (surgery) | Seiler Medical | Seiler IQ Q-100-220 | |
| Nanoparticles | Custom | Iron oxide nanoparticles (Ferumoxytol) labeled with fluorescein isothiocyanate | |
| Ophtalmic ointment | Major pharmaceuticals | Lubrifresh P.M. nighttime ointment, 203964 | |
| Oxygen | Linde Gas & Equipment Inc. | High Pressure Steel K Style Cylinder, 249CF, 2000PSIG, CGA 540 | |
| Plastic cups | Georgia-Pacirif Consumer Products | Dixie Portion Cup, 2 oz., Plastic, Clear, PK2400 | |
| Polyethylene tubing | Braintree Scientific | 50-195-5494 | |
| Scale | Ohaus Corp | CR2200 | |
| Scalpel | Integra Life Sciences Production Corp | Integra Miltex Stainless steel disposable scalpel | |
| Scissors | Fisher Scientific | 13-804-18 | |
| Sealant | Henkel Corp | Loctite 4014 | |
| Single use lab gown | High Tech Conversions | 17-444-081 | |
| Stereotactic frame | Stoelting Co. | Stoelting New Standard TM | |
| Sterile Vacuum Bottle Top Filtration Systems | Fisher Scientific | S2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE | |
| Styrofoam box | N/A | N/A | |
| Surgical gloves | Cardinal Health | 19-163-108 | |
| Surgical glue, 3M Vetbond tissues adhesive | 3M Animal Care Prodcuts | 1469SB | |
| Tail vein cathether | Custom | Consists of two 30 G cannulas connected with sillicone tubing | |
| TrypLE Express (1x), no phenol red | Invitrogen | 12604-039 | |
| Ultraviolett torch | Spring sunshine technology | Consciot |
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