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Neuroscience

ड्रोसोफिला लार्वा मस्तिष्क और सेल लाइन से पाली एक पूंछ लंबाई का मापन

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/66116
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, University of Nevada, Reno

Summary

प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला तंत्रिका तंत्र से ब्याज की जीन की पाली (ए) लंबाई की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक कुशल और विश्वसनीय विधि का वर्णन करता है, जिसे आसानी से अन्य प्रजातियों से ऊतकों या सेल प्रकारों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Abstract

पॉलीएडेनाइलेशन एक महत्वपूर्ण पोस्टट्रांसक्रिप्शनल संशोधन है जो एमआरएनए अणुओं के 3 'अंत में पॉली (ए) पूंछ जोड़ता है। पाली (ए) पूंछ की लंबाई सेलुलर प्रक्रियाओं द्वारा कसकर नियंत्रित होती है। एमआरएनए पॉलीएडेनाइलेशन का डिसरेग्यूलेशन असामान्य जीन अभिव्यक्ति और कैंसर, न्यूरोलॉजिकल विकारों और विकासात्मक असामान्यताओं सहित विभिन्न बीमारियों से जुड़ा हुआ है। इसलिए, एमआरएनए प्रसंस्करण और पोस्टट्रांसक्रिप्शनल जीन विनियमन की जटिलताओं को उजागर करने के लिए पॉलीएडेनाइलेशन की गतिशीलता को समझना महत्वपूर्ण है।

यह पत्र ड्रोसोफिला लार्वा दिमाग और ड्रोसोफिला श्नाइडर एस 2 कोशिकाओं से अलग आरएनए नमूनों में पाली (ए) पूंछ की लंबाई को मापने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। हमने गुआनोसिन/इनोसिन (G/I) टेलिंग दृष्टिकोण को नियोजित किया, जिसमें खमीर पॉली (ए) पोलीमरेज़ का उपयोग करके mRNA के 3' छोर पर G/I अवशेषों का एंजाइमेटिक जोड़ शामिल है। यह संशोधन आरएनए के 3' छोर को एंजाइमी गिरावट से बचाता है। संरक्षित पूर्ण लंबाई पाली (ए) पूंछ तो एक सार्वभौमिक antisense प्राइमर का उपयोग रिवर्स लिखित कर रहे हैं. इसके बाद, पीसीआर प्रवर्धन एक जीन-विशिष्ट ओलिगो का उपयोग करके किया जाता है जो ब्याज के जीन को लक्षित करता है, साथ ही रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए उपयोग किए जाने वाले सार्वभौमिक अनुक्रम ओलिगो के साथ।

यह ब्याज के जीन के पॉली (ए) पूंछ को शामिल करते हुए पीसीआर उत्पादों को उत्पन्न करता है। चूंकि पॉलीएडेनाइलेशन एक समान संशोधन नहीं है और इसके परिणामस्वरूप अलग-अलग लंबाई की पूंछ होती है, पीसीआर उत्पाद कई आकारों को प्रदर्शित करते हैं, जिससे अगारोज जेल पर एक धब्बा पैटर्न होता है। अंत में, पीसीआर उत्पादों को उच्च-रिज़ॉल्यूशन केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन के अधीन किया जाता है, इसके बाद पॉली (ए) पीसीआर उत्पादों और जीन-विशिष्ट पीसीआर उत्पाद के आकार का उपयोग करके मात्रा का ठहराव किया जाता है। यह तकनीक पॉली (ए) पूंछ की लंबाई का विश्लेषण करने के लिए एक सीधा और विश्वसनीय उपकरण प्रदान करती है, जिससे हमें एमआरएनए विनियमन को नियंत्रित करने वाले जटिल तंत्र में गहरी अंतर्दृष्टि प्राप्त करने में सक्षम बनाता है।

Introduction

अधिकांश यूकेरियोटिक एमआरएनए को कैनोनिकल पॉली (ए) पोलीमरेज़ द्वारा गैर-टेम्पलेटेड एडेनोसिन के अतिरिक्त नाभिक में उनके 3′ टर्मिनस पर पोस्टट्रांसक्रिप्शनल रूप से पॉलीएडेनाइलेटेड किया जाता है। एक बरकरार पाली (ए) पूंछ एमआरएनए के जीवनचक्र में महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह एमआरएनए परमाणु निर्यात1 के लिए आवश्यक है, ट्रांसलेशनल दक्षता2 को बढ़ाने के लिए पॉली (ए) -बाइंडिंग प्रोटीन के साथ बातचीत की सुविधा प्रदान करता है, और गिरावट के खिलाफ प्रतिरोध प्रदान करताहै 3. कुछ मामलों में, पाली (ए) पूंछ भी साइटोप्लाज्म में विस्तार से गुजर सकती है, जो गैर-विहित पाली (ए) पोलीमरेज़4 द्वारा सुगम है। साइटोप्लाज्म में, पॉली (ए) पूंछ की लंबाई गतिशील रूप से बदलती है और एमआरएनए अणु के जीवन काल को प्रभावित करती है। कई पोलीमरेज़ और डेडेनिलेस पूंछकी लंबाई 5,6,7 को संशोधित करने के लिए जाने जाते हैं। उदाहरण के लिए, पाली (ए) पूंछ की कमी अनुवाद दमन के साथ सहसंबंधित है, जबकि पाली (ए) पूंछ की लंबाईअनुवाद 8,9 को बढ़ाता है.

जीनोमिक अध्ययनों को जमा करने से यूकेरियोटिक जीव विज्ञान के विभिन्न पहलुओं में पॉली (ए) पूंछ की लंबाई के मूलभूत महत्व का प्रदर्शन किया गया है। यह रोगाणु कोशिका विकास, जल्दी भ्रूण विकास, सीखने और स्मृति के लिए neuronal synaptic प्लास्टिसिटी, और भड़काऊ प्रतिक्रिया10 में भूमिकाएं भी शामिल हैं. पाली (ए) पूंछ की लंबाई को मापने के लिए कई तरीके और परख विकसित किए गए हैं। उदाहरण के लिए, RNase एच/ओलिगो (डीटी) परख पाली (ए) पूंछलंबाई 11,12 का अध्ययन करने के लिए ओलिगो (डीटी) की उपस्थिति या अनुपस्थिति में RNase H का लाभ लेता है। पाली (ए) पूंछ का अध्ययन करने के अन्य तरीकों में 3 'सिरों का पीसीआर प्रवर्धन शामिल है जैसे सीडीएनए समाप्त होता है पाली (ए) परीक्षण (रेस-पीएटी)12,13और लिगेस-मध्यस्थता पाली (ए) परीक्षण (एलएम-पीएटी)14का तेजी से प्रवर्धन। पैट परख के आगे संशोधनों में ईपीएटी15 और एसपीएटी16 शामिल हैं। एंजाइमैटिक जी-टेलिंग 17,18 या 3' एंड की जी/आई-टेलिंग पैट परख के अन्य रूप हैं। इन तकनीकों के आगे संशोधन उच्च संकल्प विश्लेषण के लिए केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन के साथ फ्लोरोसेंटली लेबल प्राइमरों का उपयोग शामिल है, उच्च संकल्प पाली (ए) परीक्षण (किराया पीएटी)19के रूप में जाना जाता है. ये पीसीआर संचालित assays तेजी से और उच्च संवेदनशीलता पाली (ए) लंबाई मात्रा का ठहराव की अनुमति देते हैं.

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के विकास के साथ, एक उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण विधि, जैसे कि PAL-seq20 और TAIL-seq21, एक प्रतिलेखन-विस्तृत पैमाने पर पॉलीएडेनाइलेशन विश्लेषण की अनुमति देता है। हालांकि, ये विधियां 36-51 न्यूक्लियोटाइड के केवल लघु अनुक्रमण रीड प्रदान करती हैं। इसलिए, FLAM-Seq22 को पूर्ण लंबाई वाले mRNA की वैश्विक पूंछ लंबाई की रूपरेखा के लिए विकसित किया गया था और यह लंबे समय तक पढ़ता है। नैनोपोर प्रौद्योगिकी23 पाली (ए) पूंछ लंबाई अनुमानों के लिए पीसीआर-स्वतंत्र, प्रत्यक्ष आरएनए, या प्रत्यक्ष सीडीएनए अनुक्रमण प्रदान करता है। हालांकि, ये उच्च-थ्रूपुट विधियां सीमाओं के बिना नहीं हैं। उन्हें बड़ी मात्रा में शुरुआती सामग्री की आवश्यकता होती है, महंगी और समय लेने वाली होती है। इसके अलावा, दुर्लभ प्रतिलेखों का विश्लेषण उच्च-थ्रूपुट विधियों के साथ बेहद चुनौतीपूर्ण हो सकता है, और कम-थ्रूपुट पीसीआर-आधारित विधियां अभी भी एक लाभ प्रदान करती हैं जब पायलट प्रयोगों और अन्य तरीकों के सत्यापन के लिए कम संख्या में प्रतिलेखों का विश्लेषण करने की आवश्यकता होती है।

हमने हाल ही में प्रदर्शित किया है कि Dscam1 mRNAs में ड्रोसोफिला में छोटी पाली (ए) पूंछ होती है, जिसके लिए G/I टेलिंग विधि24का उपयोग करके Dscam1 3'UTR पर साइटोप्लाज्मिक पॉली (ए) -बाइंडिंग प्रोटीन के गैर-विहित बंधन की आवश्यकता होती है। यहाँ हम ऊतक की तैयारी और पाली की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक सुव्यवस्थित प्रक्रिया प्रदान (ए) ड्रोसोफिला तंत्रिका तंत्र और ड्रोसोफिला एस 2 कोशिकाओं से mRNAs की लंबाई.

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Protocol

1. ड्रोसोफिला लार्वा का पालन और चयन

  1. एक आर्द्र इनक्यूबेटर में 25 डिग्री सेल्सियस पर मानक फ्लाई फूड माध्यम पर फ्लाई स्ट्रेन (डब्ल्यू1118, वाइल्डटाइप) को बनाए रखें/संस्कृति करें।
  2. अंडे देने के बाद 10 भटकने वाले 3आरडी इंस्टार लार्वा 72 घंटे का चयन करें।
  3. लार्वा को 35 मिमी खाली पेट्री डिश में रखें और धीरे से लार्वा को संदंश का उपयोग करके नल के पानी वाले नए डिश में स्थानांतरित करके उन्हें धो लें। किसी भी शेष भोजन को हटाने के लिए इसे 2x करें।

2. ड्रोसोफिला लार्वा से मस्तिष्क अलगाव (चित्रा 1)

Figure 1
चित्रा 1: 3इंस्टार भटकने चरण से ड्रोसोफिला लार्वा मस्तिष्क का विच्छेदन। (ए) ड्रोसोफिला लार्वा के योजनाबद्ध चित्र। (बी-जी) लार्वा विच्छेदन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. बर्फ-ठंडा पीबीएस युक्त एक विच्छेदन पकवान पर 10 लार्वा रखें।
  2. लार्वा पृष्ठीय पक्ष (इसकी लंबाई के साथ चल रहा श्वासनली ट्यूबों द्वारा पहचान) प्लेस और पीछे अंत में शरीर की दीवार पर एक छोटा चीरा बनाने के बाद पकवान के नीचे करने के लिए प्रत्येक अंत पिन.
  3. microdissection कैंची का उपयोग पूर्वकाल अंत की ओर पृष्ठीय midline के साथ शरीर की दीवार में कटौती.
  4. संक्षेप में मस्तिष्क का पर्दाफाश करने के लिए पकवान में पीबीएस के साथ एक पाश्चर विंदुक 3x का उपयोग लार्वा के इंटीरियर फ्लश.
  5. पता लगाएँ और संदंश का उपयोग मस्तिष्क लिफ्ट और ध्यान से microdissection कैंची का उपयोग कर इसे अलग.
  6. विच्छेदित दिमाग को बर्फ पर बर्फ-ठंडे पीबीएस से भरे 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें; सभी लार्वा दिमाग ले लीजिए. धारा 4 में वर्णित के रूप में एक शाही सेना microprep किट का उपयोग कर शाही सेना निष्कर्षण के साथ आगे बढ़ें.
    नोट: ऊतक क्षति और शाही सेना के क्षरण को रोकने के लिए 15 मिनट के भीतर 10 लार्वा का विच्छेदन करें।

3. ड्रोसोफिला एस 2 श्नाइडर कोशिकाएं

  1. ड्रोसोफिला श्नाइडर के माध्यम में ड्रोसोफिला एस 2 कोशिकाओं को बढ़ाएं, न्यूनतम 90% व्यवहार्यता के साथ 8 × 10 6 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व के लिए एक आर्द्र इनक्यूबेटर में 25 डिग्री सेल्सियस पर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक 106 कोशिकाओं / एमएल × 106 कोशिकाओं / एमएल।
  2. 50 एमएल बाँझ शंक्वाकार ट्यूब में, श्नाइडर के ड्रोसोफिला माध्यम के साथ 2.5 × 106 कोशिकाओं / एमएल को पतला करें जो 10% एफबीएस के साथ पूरक है जिसे 25 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया गया है।
  3. सेल निलंबन (20 × 106 कोशिकाओं) के 8 एमएल को 100 मिमी संस्कृति प्लेट में स्थानांतरित करें और इसे 12 एमएल (दिन 1) बनाने के लिए 4 एमएल जोड़ें।
  4. एक आर्द्र इनक्यूबेटर में 25 डिग्री सेल्सियस पर सुसंस्कृत कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    नोट: कोशिकाएं शिथिल रूप से 12-16 घंटे (दिन 2) के बाद प्लेट का पालन करती हैं।
  5. उपयुक्त डीएनए प्लास्मिड24 के साथ कोशिकाओं को ट्रांसफ़ेक्ट करें।
  6. एक आर्द्र इनक्यूबेटर में 48 घंटे के लिए सेते हैं.
  7. इनक्यूबेशन के बाद, कोमल पाइपिंग (दिन 4) द्वारा बर्फ-ठंडा पीबीएस के 5 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
  8. कोशिकाओं को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 1,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजिंग द्वारा कोशिकाओं को गोली मारें।
  10. कोमल पाइपिंग द्वारा बर्फ-ठंडे पीबीएस के साथ कोशिकाओं को 2x कुल्ला और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 1,000 × ग्राम पर उन्हें सेंट्रीफ्यूज करके कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
  11. एक शाही सेना miniprep किट का उपयोग कर शाही सेना निष्कर्षण प्रदर्शन.
    नोट: एक बाँझ लामिना का प्रवाह हुड के अंदर निम्न चरणों का पालन करें.

4. ड्रोसोफिला लार्वा मस्तिष्क और एस 2 कोशिकाओं से कुल आरएनए निष्कर्षण

  1. लार्वा मस्तिष्क: संक्षिप्त centrifugation (5,000 × ग्राम पर 8 एस लघु स्पिन) द्वारा पीबीएस निकालें.
  2. आरएनए लाइसिस बफर के 600 माइक्रोन जोड़ें और प्लास्टिक मूसल के साथ 10x को समरूप करें। नेत्रहीन एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत ट्यूब का निरीक्षण पूरा lysis सुनिश्चित करने के लिए.
  3. ऊतक मलबे को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 1,000 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र। साफ सतह पर तैरनेवाला एक न्यूक्लियस मुक्त microcentrifuge ट्यूब में स्थानांतरण.
  4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक आरएनए microprep किट का उपयोग कर शाही सेना को अलग करें.
    नोट: नमूनों में मौजूद आरएनए की छोटी मात्रा के कारण लार्वा मस्तिष्क के नमूनों के लिए आरएनए माइक्रोप्रेप किट का उपयोग आवश्यक है।
  5. S2 कोशिकाएं: पीबीएस निकालें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार शाही सेना को अलग करें।
  6. स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री और एगरोज जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा आरएनए उपज और गुणवत्ता को मापें।
    1. क्रमशः ए260 एनएम और ए280 एनएम पर निकाले गए आरएनए के ऑप्टिकल घनत्व को मापकर निकाले गए आरएनए की शुद्धता और मात्रा निर्धारित करें। सुनिश्चित करें कि ए260 एनएम/ए280 एनएम अनुपात ≥2.0 है और बहाव अनुप्रयोगों के लिए आरएनए एकाग्रता >350 एनजी/माइक्रोन है।
      नोट: 10 ड्रोसोफिला लार्वा दिमाग से एक विशिष्ट आरएनए उपज ~ 500-800 एनजी / S2 कोशिकाओं के लिए, उपज ~ 2-3 μg/μL (15 μL में 15-30 μg) है। पृथक शाही सेना लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.

5. आरएनए जेल और वैद्युतकणसंचलन की तैयारी

  1. 1.5% विकृतीकरण आरएनए जेल (100 एमएल)
    नोट: फॉर्मलाडेहाइड त्वचा के संपर्क और वाष्प के साँस लेना के माध्यम से विषाक्त है; इसे एक रासायनिक धूआं हुड में संभालें।
    1. एमओपीएस बफर (पूरक फ़ाइल 1) के 82 एमएल में तीन अगारोज टैबलेट (1.5 ग्राम) को भंग करें जब तक कि गोलियां पूरी तरह से ठीक कणों को बनाने के लिए टूट न जाएं।
    2. अगारोज घोल को माइक्रोवेव में तब तक गर्म करें जब तक कि घोल साफ न हो जाए और सभी कण पूरी तरह से घुल न जाएं।
    3. समाधान को ~ 60 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
    4. 37% फॉर्मलाडेहाइड के 18 एमएल जोड़ें, फिर कोमल घूमता द्वारा मिलाएं। कास्टिंग ट्रे में समाधान डालो और यह एक धूआं हुड में जमना करते हैं.
  2. आरएनए नमूना तैयार करना और वैद्युतकणसंचलन
    1. आरएनए नमूने को 200 एनजी (5 माइक्रोन में) पतला करें और 2x आरएनए लोडिंग डाई के 5 माइक्रोन जोड़ें।
    2. एक सूखे स्नान में 5 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर नमूने गर्मी.
    3. पहली लेन में आरएनए सीढ़ी के 2 माइक्रोन और आसन्न गलियों में नमूनों के 10 माइक्रोन लोड करें।
    4. एमओपीएस बफर में 5 x 6 सेमी जेल के लिए 60 मिन के लिए 100 वी पर वैद्युतकणसंचलन करें।
      नोट: एम्प्लिकॉन आकार के आधार पर वैद्युतकणसंचलन की स्थिति को समायोजित करें।
    5. एक यूवी ट्रांसिल्यूमिनेटर पर जेल की कल्पना करें।
      नोट: एक एकल बैंड ~ 600 न्यूक्लियोटाइड आकार की उपस्थिति बरकरार आरएनए तैयारी को इंगित करती है ( चित्र 2 ए देखें)।

6. पाली (ए) पूंछ लंबाई माप

Figure 2
चित्रा 2: आरएनए नमूना तैयार करने और पाली (ए) -पूंछ परख। (ए) आरएनए जेल छवियां ड्रोसोफिला लार्वा मस्तिष्क (बाएं) और एस 2 कोशिकाओं (दाएं) से 1.5% फॉर्मलाडेहाइड एगरोज जेल पर कुल आरएनए दिखाती हैं। एकल-फंसे आरएनए सीढ़ी के आकार को लेन एम पर न्यूक्लियोटाइड में दिखाया गया है, ~ 600 एनटी पर एक प्रमुख आरएनए बैंडिंग पर ध्यान दें, जो आरआरएनए से है। (बी) पाली (ए) -पूंछ परख के स्कीमैटिक्स। संक्षिप्तीकरण: G/I = गुआनोसिन/इनोसिन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. जीआई टेलिंग (चित्र 2बी)
    1. बर्फ पर अभिकर्मकों रखते हुए, निम्नलिखित मिश्रण (20 माइक्रोन) तैयार करें: कुल आरएनए नमूने (1 माइक्रोग्राम) के 14 माइक्रोन तक, 5x टेल बफर मिक्स के 4 माइक्रोन, और 10x टेल एंजाइम मिश्रण के 2 माइक्रोन।
    2. एक थर्मोसाइक्लर में 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    3. पूंछ बंद समाधान के 1.5 माइक्रोन जोड़ें; 2 मिनट के लिए बर्फ पर रखो.
      नोट: रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए आगे बढ़ें या जीआई-टेल्ड आरएनए नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए आगे बढ़ने के लिए तैयार न हो।
  2. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और पीसीआर प्रवर्धन
    1. मिश्रण तैयार करने और पूरक फ़ाइल 1 में वर्णित शर्तों के तहत इसे इनक्यूबेट करके सीडीएनए को संश्लेषित करें।
    2. सीडीएनए नमूनों को पतला करें और पूरक फ़ाइल 1 में बताए अनुसार डीएनए को बढ़ाने के लिए पीसीआर करें।

7. पीसीआर उत्पाद विश्लेषण agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा

  1. गुणवत्ता नियंत्रण के लिए 45 मिनट के लिए 100 वी पर वैद्युतकणसंचलन द्वारा 2.5% अगारोज जेल पर चरण 6.2.2 से पीसीआर उत्पादों के एक छोटे से हिस्से (2-5 माइक्रोन) का विश्लेषण करें।
  2. जेल-निकाले गए पीसीआर बैंड को अनुक्रमित करके जीन-विशिष्ट और पूंछ-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं के लिए पीसीआर की विशिष्टता को सत्यापित करें।

8. केशिका वैद्युतकणसंचलन

  1. उच्च संवेदनशीलता डीएनए किट के साथ बायोएनालाइज़र का उपयोग करके जीन-विशिष्ट और पॉली (ए) -विशिष्ट पीसीआर से पीसीआर उत्पादों (0.5-5 एनजी/जेडएल) के 1 माइक्रोन पर उच्च-रिज़ॉल्यूशन जेल वैद्युतकणसंचलन करें। एक सफल रन का संकेत देने वाली अच्छी तरह से हल की गई चोटियों की तलाश करें।

9. डेटा विश्लेषण: पाली (ए) पूंछ लंबाई माप (चित्रा 3)

Figure 3
चित्रा 3: पाली (ए) पूंछ की लंबाई और शिखर मूल्य माप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. डेटा एक्सेस करना
    1. डेटा तक पहुंचने के लिए, सॉफ्टवेयर में xad फ़ाइल खोलें।
    2. ट्री व्यू पैनल में नमूना नाम या सीढ़ी का चयन करें।
      नोट: यह चयनित नमूनों के लिए इलेक्ट्रोफेरोग्राम या जेल जैसी छवियों के रूप में परिणाम दिखाएगा। निचला मार्कर 35 आधार जोड़ी (बीपी) और ऊपरी मार्कर 10,380 बीपी नमूना कुओं से डेटा के साथ सीढ़ी डेटा (50-7,000 बीपी) संरेखित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले आंतरिक मानक हैं।
    3. विवरण प्रदर्शित करने के लिए इलेक्ट्रोफेरोग्राम और जेल जैसी छवियों को ज़ूम इन और आउट करें।
  2. शिखर और धब्बा विश्लेषण करना
    1. चोटी आकार प्राप्त करने के लिए, एक चयनित नमूने के इलेक्ट्रोफेरोग्राम खुला.
    2. इलेक्ट्रोफेरोग्राम पर राइट-क्लिक करें और क्षैतिज रेखा खींचकर चोटियों को मैन्युअल रूप से चुनने के लिए मैन्युअल एकीकरण का चयन करें।
    3. पीक तालिका में शिखर मूल्यों का निरीक्षण करें। सबसे बड़ी चोटी की ऊंचाई के साथ पहचानें। यह एक व्यक्तिगत नमूने के लिए पाली (ए) पूंछ की लंबाई का एक शिखर है। दिखाए गए उदाहरण में, यह 346 बीपी है।
    4. शीर्ष मेनू पर सेटपॉइंट दिखाएं/छुपाएं आइकन सक्षम करें और दाईं ओर एक नए पैनल के पॉप अप होने की प्रतीक्षा करें।
    5. उन्नत का चयन करें, स्मीयर विश्लेषण निष्पादित करने के लिए नीचे स्क्रॉल करें और चेक बॉक्स का चयन करें. यह क्षेत्र तालिका को इलेक्ट्रोफेरोग्राम टैब में जोड़ देगा।
    6. एक नमूने से एक इलेक्ट्रोफेरोग्राम का चयन करें और क्षेत्र तालिका पर जाएं, जो फ्रॉम [बीपी] और टू [बीपी] मेनू दिखाता है। प्रारंभ और समाप्ति [बीपी] सेट करने के लिए, इलेक्ट्रोफेरोग्राम पर राइट-क्लिक करें और क्षेत्र जोड़ें जोड़ने के लिए क्षेत्र का चयन करें.
    7. क्षेत्र तालिका में किसी भी सेल पर राइट क्लिक करें और कस्टम क्षेत्रों सेट किया जा सकता है, जहां एक छोटी सी नई विंडो पॉप अप बनाने के लिए क्षेत्र संशोधित करें का चयन करें.
      नोट: उदाहरण के लिए, हमने जीएपीडीएच के लिए 300 बीपी से 550 बीपी के क्षेत्र का उपयोग किया। जीन-विशिष्ट जीएपीडीएच पीसीआर ने 265 बीपी पर एक चोटी प्राप्त की। सार्वभौमिक प्राइमर (तालिका 1) जी/आई-पूंछ वाले आरएनए को एनीलिंग के माध्यम से 35 बीपी द्वारा पॉली (ए) पीसीआर की लंबाई बढ़ाता है। इस प्रकार, जीएपीडीएच आरएनए पर पहला एडेनिन न्यूक्लियोटाइड 300 बीपी (265 + 35) से शुरू होता है। हमने मनमाने ढंग से अधिकतम पॉली (ए) पूंछ की लंबाई को 250 (300 + 250 = 550) तक सीमित कर दिया। क्षेत्र तालिका से, कार्यक्रम 387 बीपी के रूप में क्षेत्र के भीतर औसत आकार देता है।
    8. ब्याज के mRNA पर पाली (ए) पूंछ की लंबाई की गणना करने के लिए समीकरण (1) का प्रयोग करें:
      पॉली (ए) पूंछ की लंबाई = (ए - बी - 35) (1)
      जहां ए इलेक्ट्रोफेरोग्राम (यानी, जीएपीडीएच के लिए 387 बीपी) से पॉली (ए) -विशिष्ट पीसीआर उत्पाद का औसत बीपी है, बी इलेक्ट्रोफेरोग्राम (यानी, जीएपीडीएच के लिए 265 बीपी) से जीन-विशिष्ट पीसीआर उत्पाद का शिखर बीपी है, और "35" सार्वभौमिक रिवर्स प्राइमर टैग की लंबाई है।
      नोट: उपरोक्त गणना से, जीएपीडीएच की औसत पॉली (ए) पूंछ की लंबाई 387 - 265 - 35 = 87 बीपी है।

10. पाली (ए) पूंछ लंबाई वितरण की कल्पना

  1. फ़ाइल के अंतर्गत डेटा को csv फ़ाइल के रूप में निर्यात करें | निर्यात | नमूना डेटा पुनर्प्राप्त करने के लिए नमूना डेटा।
    नोट: निर्यात की गई csv फ़ाइल X-अक्ष पर bp के बजाय रन टाइम प्रदर्शित करती है।
  2. एक नमूने के एक इलेक्ट्रोफेरोग्राम पर जाएं और इलेक्ट्रोफेरोग्राम टैब पर शो साइज पर जांच करें ताकि क्षेत्र तालिका पर क्षेत्र तालिका को स्वचालित रूप से बीपी से रन टाइम में परिवर्तित किया जा सके। उदाहरण में, 70ण्39 े से 86ण्28 े 300 इच से 550 इच के तदनुरूपी है।
  3. CSV फ़ाइल खोलें और ग्राफ़ जनरेट करने के लिए रन टाइम के 70.39 s से 86.28 s तक के मानों का चयन करें। ग्राफ पर एक्स-अक्ष पर बीपी आकार की कल्पना करने के लिए, बीपी आकार के साथ इलेक्ट्रोफेरोग्राम को एक छवि फ़ाइल के रूप में निर्यात करें और इसे स्प्रेडशीट में उत्पन्न ग्राफ पर ओवरले करें। यह उचित रूप से पाली (ए) पूंछ वितरण पर बीपी आकार से मेल खाएगा।

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Representative Results

यहां, हमने ड्रोसोफिला लार्वा दिमाग(चित्रा 4)से डीस्कैम1 और जीएपीडीएच की पाली (ए) पूंछ की लंबाई का विश्लेषण किया। पृथक आरएनए गुणवत्ता नियंत्रण के लिए एक agarose जेल पर कल्पना की गई. लगभग 600 न्यूक्लियोटाइड आकार में एक एकल आरएनए बैंड बरकरार आरएनए तैयारी(चित्रा 2ए)को इंगित करता है। आरएनए को एगिलेंट 2100 बायोएनालाइज़र का उपयोग करके जी/आई टेलिंग और उच्च-रिज़ॉल्यूशन केशिका वैद्युतकणसंचलन के अधीन किया गया था। जेल छवियों को एजिलेंट 2100 विशेषज्ञ सॉफ्टवेयर का उपयोग करके निर्यात किया गया था और तदनुसार इकट्ठा किया गया था। जीएपीडीएच और डीएसएएम 1 जीन-विशिष्ट प्राइमर जोड़े के पीसीआर उत्पादों ने एक अलग एकल बैंड दिखाया, जबकि जीन-विशिष्ट/सार्वभौमिक प्राइमर जोड़े से अलग-अलग स्मीयर पैटर्न(चित्रा 4ए और टेबल 1)दिखाया गया, जो अंतर पॉली (ए) को इंगित करता है। चित्रा 4 बी में, स्मीयर विश्लेषण का उपयोग जीएपीडीएच और डीएसएएम1से औसत पाली (ए) पूंछ लंबाई प्राप्त करने के लिए किया गया था। इलेक्ट्रोफेरोग्राम निर्यात किए गए और पाली (ए) पूंछ की लंबाई (चित्रा 4 सी) का प्रतिनिधित्व करने के लिए संशोधित किए गए।

इसी तरह, हमने एस 2 कोशिकाओं (चित्रा 5) पर एक पाली (ए) पूंछ लंबाई विश्लेषण किया। पाली (ए) पूंछ को छोटा करने में Dscam1 3'UTR की भूमिका निर्धारित करने के लिए, S2 कोशिकाओं को डीएनए प्लास्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था जिसमें Dscam1 कोडिंग क्षेत्र या तो SV40 3'UTR या Dscam1 3'UTR था। न्यूनतम SV40 3'UTR को Dscam1 3'UTR के नियंत्रण के लिए चुना गया था क्योंकि SV40 3'UTR का व्यापक रूप से पुनः संयोजक डीएनए प्लास्मिड के लिए न्यूनतम प्रतिलेखन समाप्ति और पॉलीएडेनाइलेशन सिग्नल के रूप में उपयोग किया गया है। कुल आरएनए निकाला गया था और आरटी-पीसीआर, जी/आई टेलिंग, और उच्च-रिज़ॉल्यूशन केशिका वैद्युतकणसंचलन(चित्रा 5)के अधीन किया गया था। परिणाम से पता चलता है कि SV40 3'UTR प्लास्मिड से पाली (ए) पूंछ की लंबाई वितरण अंतर्जात GAPDH के समान पैटर्न का पालन करता है, जबकि Dscam1 3'UTR प्लास्मिड से पाली (ए) पूंछ की लंबाई वितरण लार्वा दिमाग से अंतर्जात Dscam1 mRNA के समान पैटर्न का पालन करता है।

Figure 4
चित्रा 4: पॉली (ए) लार्वा दिमाग से जीएपीडीएच और डीएसएएम 1 की पूंछ की लंबाई माप। (ए) केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन जीएपीडीएच 2 और डीएसएएम 1 के लिए असतत बैंड (पहली और दूसरी लेन) के रूप में जीन-विशिष्ट पीसीआर उत्पाद को हल करता है। यूनिवर्सल रिवर्स प्राइमर का उपयोग करके पीसीआर उत्पाद एक स्मीयर वितरण (तीसरी और चौथी लेन) दिखाता है। * गैर-विशिष्ट बैंड। (बी) औसत पाली (ए) -पूंछ लंबाई धब्बा विश्लेषण का उपयोग कर गणना की गई. (सी) पॉली (ए) पूंछ की लंबाई का वितरण निर्यात किए गए सीएसवी फ़ाइल से पुनर्निर्माण किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: पॉली (ए) ट्रांसफ़ेक्ट डीएसएएम 1 डीएनए प्लास्मिड की पूंछ लंबाई माप। सुसंस्कृत ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं को Dscam1 निर्माणों के साथ सह-ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था जिसमें Dscam1 का कोडिंग क्षेत्र और Dscam1 या SV40 का 3′UTR शामिल है। (ए) केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन छवियों को जीन-विशिष्ट पीसीआर उत्पाद के लिए एसवी 40 (डीएसकैम 1-एसवी 40 3'यूटीआर) और डीएससीए1 (डीस्कैम 1-डीएसकैम 1 3'यूटीआर) के लिए असतत बैंड (पहली और दूसरी लेन) के रूप में दिखाया गया है। यूनिवर्सल रिवर्स प्राइमर का उपयोग करने वाला पीसीआर उत्पाद एक स्मीयर पैटर्न (तीसरी और चौथी लेन) दिखाता है। * गैर-विशिष्ट बैंड। (बी) औसत पाली (ए) -पूंछ लंबाई धब्बा विश्लेषण का उपयोग कर गणना की गई. (सी) पाली (ए) पूंछ लंबाई वितरण निर्यात सीएसवी फ़ाइल से पुनर्निर्माण किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

डीस्कैम1
फॉरवर्ड प्राइमर (5'-3') CGCAGCCACAAACATGAATG
रिवर्स प्राइमर (5'-3') AAATAAAATCAAAATCATATATTTAGCAACTTATGAAC
एसवी40
फॉरवर्ड प्राइमर (5'-3') CCACAAAGGAAAAAGCTGCAC
रिवर्स प्राइमर (5'-3') TTTATTTGTGAAATTTGATGCTATGCTTTTTTTTTTG
जीएपीडीएच
फॉरवर्ड प्राइमर (5'-3') CACTTCAGAAACGGCCTGAAAATGGC
रिवर्स प्राइमर (5'-3') AATATTTAAATGCTTATGAGTCGGCATTTTTAAAACTAC
यूनिवर्सल रिवर्स प्राइमर
रिवर्स प्राइमर (5'-3') GGTAATACGACTCACTATAGCGAGACCCCCCCCTT

तालिका 1: प्राइमरों इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया.

पूरक फ़ाइल 1: समाधान और पीसीआर सेटअप की संरचना। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हम ड्रोसोफिला लार्वा मस्तिष्क भटक 3इंस्टार चरण के साथ ही ड्रोसोफिला एस 2 कोशिकाओं से नमूना तैयार से काटना करने के लिए तकनीक का वर्णन. एमआरएनए की अस्थिर प्रकृति के कारण, नमूना संग्रह के लिए अतिरिक्त सावधानी की आवश्यकता होती है। लार्वा मस्तिष्क विच्छेदन के लिए, मस्तिष्क अलगाव के दौरान क्षतिग्रस्त नहीं किया जाना चाहिए और एक लंबे समय के लिए समाधान में नहीं रखा जाना चाहिए. विच्छेदन के एक दौर के लिए 8-10 मिनट के लिए विच्छेदन समय रखते हुए आवश्यक है. यह भी RNAase अवरोधकों के साथ विच्छेदन समाधान के पूरक के लिए फायदेमंद हो सकता है. S2 सेल संवर्धन और अभिकर्मक के लिए के रूप में, लामिना का प्रवाह हुड में सभी कदम बाहर ले.

आरएनए अलगाव कदम अतिरिक्त विचार की आवश्यकता है. हम एक लामिना का प्रवाह प्रकार साफ जगह है कि RNase हटाने समाधान के साथ pretreated है का उपयोग करने की सिफारिश. आरएनए उपज के अलावा, यह सुनिश्चित करने के लिए आरएनए अखंडता की जांच करना आवश्यक है कि नमूना विच्छेदन और अलगाव चरणों के दौरान अपमानित नहीं किया गया है। आरएनए अखंडता को अगारोज जेल वैद्युतकणसंचलन को विकृत करके देखा जा सकता है। ड्रोसोफिला से कुल आरएनए एक एकल बैंडिंग प्रोफ़ाइल प्रदर्शित करता है क्योंकि 28S rRNA को दो समान आकार के सबयूनिट्स में अलग किया जाता है, जो 18S rRNA25 के साथ मेल खाता है। यह एक एकल फंसे आरएनए सीढ़ी(चित्रा 2ए)का उपयोग करते समय लगभग 600 न्यूक्लियोटाइड के एकल बैंड के रूप में देखा जा सकता है।

पृथक आरएनए नमूने जी/आई टेलिंग(चित्रा 2बी)के अधीन हैं। गुआनोसिन और इनोसिन अवशेषों को खमीर पाली (ए) पोलीमरेज़ (पीएपी) 17 द्वारा आरएनए के 3 'अंत में जोड़ा जाता है, जो एंजाइमी गिरावट से आरएनए के 3′-छोर को संरक्षित करता है। नए संश्लेषित जी/आई-टैग-संरक्षित पूर्ण-लंबाई वाले आरएनए सार्वभौमिक रिवर्स प्राइमर (3'-टैग किए गए C10T2) का उपयोग करके सीडीएनए नमूने प्राप्त करने के लिए रिवर्स-ट्रांसक्राइब किए गए हैं। एक पीसीआर उत्पाद उत्पन्न करने के लिए पॉलीएडेनाइलेशन साइट के जीन-विशिष्ट फॉरवर्ड / रिवर्स प्राइमरों के साथ एक पीसीआर द्वारा पीछा किया गया जो एक तेज बैंड दिखाता है। जीन-विशिष्ट फॉरवर्ड और सार्वभौमिक रिवर्स प्राइमरों से पीसीआर प्रतिक्रियाएं जेल पर धब्बा के रूप में डीएनए अणुओं की अपरिभाषित लंबाई उत्पन्न करती हैं, जो पॉली (ए) पूंछ की अलग-अलग लंबाई को दर्शाती है। पीसीआर उत्पादों को बाद में केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा विश्लेषण किया गया था।

प्राइमरों को डिजाइन करते समय, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि जीन-विशिष्ट फॉरवर्ड/रिवर्स प्राइमरों के साथ एम्प्लिकॉन का आकार 50-300 बीपी की सीमा में होना चाहिए। कई फॉरवर्ड प्राइमरों का परीक्षण करने से सबसे अच्छा प्राइमर खोजने का अवसर मिलता है जो पॉली (ए) पूंछ मूल्यांकन के लिए काम करता है। हम सिर्फ भविष्यवाणी पाली (ए) शुरू साइट के ऊपर की ओर जीन विशिष्ट उत्पादों के लिए एक रिवर्स प्राइमर डिजाइन करने की सलाह देते हैं क्योंकि यह पाली (ए) पूंछ लंबाई की सीधी गणना के लिए एक अवसर प्रदान करता है. पीसीआर प्रतिक्रियाओं को चलाते समय, दूषित जीनोमिक डीएनए से प्रवर्धन को रद्द करने के लिए "कोई रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस नियंत्रण" करना महत्वपूर्ण है। एक annealing तापमान ढाल के साथ पीसीआर अनुकूलन अत्यधिक अनुशंसित है। इस पद्धति की प्रकृति को देखते हुए, वैकल्पिक रूप से पॉलीएडेनाइलेटेड एमआरएनए प्रजातियों की पाली (ए) पूंछ की लंबाई का विश्लेषण करने के लिए अतिरिक्त विचार की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, कई जीन विभिन्न 3'यूटीआर प्रजातियों26 उत्पन्न करने के लिए वैकल्पिक पॉलीएडेनाइलेशन से गुजरते हैं। हम अलग-अलग 3'UTR प्रजातियों का अध्ययन करने के लिए विभिन्न पीसीआर प्राइमर सेट का उपयोग करने की सलाह देते हैं।

हम प्रत्येक रन में केशिका जेल वैद्युतकणसंचलन पर जीन-विशिष्ट पीसीआर उत्पाद सहित अत्यधिक अनुशंसा करते हैं क्योंकि प्रत्येक रन में कुछ न्यूक्लियोटाइड का संभावित प्रवास अंतर होता है। यह आवश्यक है कि जीन-विशिष्ट पीसीआर के वास्तविक आधार जोड़ी आकार का उपयोग सैद्धांतिक आकारों के बजाय किया जाता है जब पाली (ए) पूंछ की लंबाई की गणना की जाती है।

कुछ आरएनए अतिरिक्त posttranscriptional संशोधनों से गुजरना, टर्मिनल uridylation27 सहित. जी/आई टेलिंग विधि पॉली (ए) पूंछ की लंबाई को मापने के लिए उपयुक्त नहीं हो सकती है जब एमआरएनए यूरिडिलेट होता है। ऐसा इसलिए है क्योंकि सार्वभौमिक रिवर्स प्राइमर एमआरएनए प्रजातियों को कुशलता से नहीं बढ़ा सकता है जिनके 3'-एंड पर नॉन एडेनिन न्यूक्लियोटाइड होते हैं। G/I टेलिंग एक पीसीआर-आधारित विधि है, जो संभावित रूप से छोटे टुकड़ों को अधिक कुशलता से बढ़ाकर अवांछित पूर्वाग्रह पैदा करती है। इस प्रकार, परिणाम की व्याख्या करते समय उपयोगकर्ताओं को सतर्क रहना चाहिए।

यहां प्रस्तुत विधि का उपयोग करते हुए, हमने प्रदर्शित किया कि ड्रोसोफिला तंत्रिका तंत्र और एस 2 कोशिकाओं से पाली (ए) पूंछ की लंबाई को मापने के लिए जी / आई टेलिंग का कुशलतापूर्वक उपयोग किया जा सकता है। केशिका वैद्युतकणसंचलन के साथ युग्मित होने पर विधि अत्यधिक मात्रात्मक होती है। जबकि उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण वैश्विक पॉली (ए) पूंछ विश्लेषण प्रदान करते हैं, कम-थ्रूपुट पीसीआर-आधारित विधि जी / आई टेलिंग अभी भी एकल-प्रतिलेख विश्लेषण, पायलट प्रयोगों और अन्य तरीकों के सत्यापन के लिए बहुत उपयोगी है। संक्षेप में, विधि का चुनाव विशिष्ट शोध प्रश्नों और लक्ष्यों पर निर्भर करता है। शोधकर्ताओं को उस विधि का चयन करना चाहिए जो उनकी प्रयोगात्मक आवश्यकताओं और संसाधनों के लिए सबसे उपयुक्त हो।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर एंड स्ट्रोक ग्रांट R01NS116463 से जेके, और नेवादा विश्वविद्यालय, रेनो में सेलुलर और आणविक इमेजिंग कोर सुविधा द्वारा समर्थित किया गया था, जिसे नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट P20GM103650 द्वारा समर्थित किया गया था और इस अध्ययन में रिपोर्ट किए गए शोध के लिए उपयोग किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) Research Product Internation (RPI) M92020
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies  5067-4626
Agilent software 2100 expert free download demo Agilent Technologies https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259
Apex 100 bp-Low DNA Ladder Genesee Scientific 19-109
Bioanalyzer Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Research Product Internation (RPI)  D43060
DNA dye (Gel Loading Dye, Purple (6x) New England biolabs  B7024S
Drosophila S2 cell line Drosophila Genomics Resource Center stock #181
Drosophila Schneider’s Medium Thermo Fisher Scientific 21720024
Ehidium bromide Genesee scientific  20-276
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F4135
Forceps Dumont 5   Fine Science tools  11254-20
Nuclease free water Thermo Fisher Scientific  AM9932
PBS 10x Research Product Internation (RPI)  P32200
Poly(A) Tail-Length Assay Kit Thermo Fisher Scientific  764551KT
RiboRuler Low Range RNA Ladder Thermo Fisher Scientific  SM1833
RNA Gel Loading Dye (2x) Thermo Fisher Scientific  R0641
RNA microprep kit Zymoresearch  R1050 
RNA miniprep kit Zymoresearch  R1055
Scissors-Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge Fine Science tools  15000-08
TopVision Agarose Tablets Thermo Fisher Scientific R2802
Tris-Acetate-EDTA (TAE) Thermo Fisher Scientific B49

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References

  1. Stewart, M. Polyadenylation and nuclear export of mRNAs. Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 2977-2987 (2019).
  2. Machida, K., et al. Dynamic interaction of poly(A)-binding protein with the ribosome. Scientific Reports. 8 (1), 17435 (2018).
  3. Eisen, T. J., et al. The dynamics of cytoplasmic mRNA metabolism. Molecular Cell. 77 (4), 786-799 (2020).
  4. Liudkovska, V., Dziembowski, A. Functions and mechanisms of RNA tailing by metazoan terminal nucleotidyltransferases. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 12 (2), e1622 (2021).
  5. Goldstrohm, A. C., Wickens, M. Multifunctional deadenylase complexes diversify mRNA control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (4), 337-344 (2008).
  6. Schmidt, M. J., Norbury, C. J. Polyadenylation and beyond: emerging roles for noncanonical poly(A) polymerases. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 1 (1), 142-151 (2010).
  7. Laishram, R. S. Poly(A) polymerase (PAP) diversity in gene expression - Star-PAP vs canonical PAP. FEBS Letters. 588 (14), 2185-2197 (2014).
  8. Salles, F. J., Lieberfarb, M. E., Wreden, C., Gergen, J. P., Strickland, S. Coordinate initiation of Drosophila development by regulated polyadenylation of maternal messenger RNAs. Science. 266 (5193), 1996-1999 (1994).
  9. Wreden, C., Verrotti, A. C., Schisa, J. A., Lieberfarb, M. E., Strickland, S. Nanos and pumilio establish embryonic polarity in Drosophila by promoting posterior deadenylation of hunchback mRNA. Development. 124 (15), 3015-3023 (1997).
  10. Passmore, L. A., Coller, J. Roles of mRNA poly(A) tails in regulation of eukaryotic gene expression. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (2), 93-106 (2021).
  11. Murray, E. L., Schoenberg, D. R. Assays for determining poly(a) tail length and the polarity of mRNA decay in mammalian cells. Methods in Enzymology. 448, 483-504 (2008).
  12. Salles, F. J., Strickland, S. Analysis of poly(a) tail lengths by PCR: The PAT assay. Methods in Molecular Biology. 118, 441-448 (1999).
  13. Salles, F. J., Darrow, A. L., O'Connell, M. L., Strickland, S. Isolation of novel murine maternal mRNAs regulated by cytoplasmic polyadenylation. Genes and Development. 6 (7), 1202-1212 (1992).
  14. Salles, F. J., Strickland, S. Rapid and sensitive analysis of mRNA polyadenylation states by PCR. Genome Research. 4 (6), 317-321 (1995).
  15. Janicke, A., Vancuylenberg, J., Boag, P. R., Traven, A., Beilharz, T. H. ePAT: A simple method to tag adenylated RNA to measure poly(a)-tail length and other 3' RACE applications. RNA. 18 (6), 1289-1295 (2012).
  16. Minasaki, R., Rudel, D., Eckmann, C. R. Increased sensitivity and accuracy of a single-stranded DNA splint-mediated ligation assay (sPAT) reveals poly(a) tail length dynamics of developmentally regulated mRNAs. RNA Biology. 11 (2), 111-123 (2014).
  17. Martin, G., Keller, W. Tailing and 3'-end labeling of RNA with yeast poly(A) polymerase and various nucleotides. RNA. 4 (2), 226-230 (1998).
  18. Kusov, Y. Y., Shatirishvili, G., Dzagurov, G., Verena, G. M. A new G-tailing method for the determination of the poly(a) tail length applied to hepatitis a virus RNA. Nucleic Acids Research. 29 (12), 57 (2001).
  19. Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
  20. Subtelny, A. O., Eichhorn, S. W., Chen, G. R., Sive, H., Bartel, D. P. Poly(a)-tail profiling reveals an embryonic switch in translational control. Nature. 508 (1), 66-71 (2014).
  21. Chang, H., Lim, J., Ha, M., Kim, V. N. TAIL-seq: Genome-wide determination of poly(a) tail length and 3' end modifications. Molecular Cell. 53 (6), 1044-1052 (2014).
  22. Legnini, I., Alles, J., Karaiskos, N., Ayoub, S., Rajewsky, N. FLAM-seq: Full-length mRNA sequencing reveals principles of poly(A) tail length control. Nature Methods. 16 (9), 879-886 (2019).
  23. Garalde, D. R., et al. Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores. Nature Methods. 15 (3), 201-206 (2018).
  24. Singh, M., Ye, B., Kim, J. H. Dual leucine zipper kinase regulates Dscam expression through a noncanonical function of the cytoplasmic poly(A)-binding protein. Journal of Neuroscience. 42 (31), 6007-6019 (2022).
  25. Macharia, R. W., Ombura, F. L., Aroko, E. O. Insects' RNA profiling reveals absence of "hidden break" in 28S ribosomal RNA molecule of onion thrips, Thrips tabaci. Journal of Nucleic Acids. 2015, 965294 (2015).
  26. Miura, P., Sanfilippo, P., Shenker, S., Lai, E. C. Alternative polyadenylation in the nervous system: to what lengths will 3' UTR extensions take us. Bioessays. 36 (8), 766-777 (2014).
  27. Sement, F. M., et al. et al Uridylation prevents 3' trimming of oligoadenylated mRNAs. Nucleic Acids Research. 41 (14), 7115-7127 (2013).

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तंत्रिका विज्ञान अंक 203
<em>ड्रोसोफिला</em> लार्वा मस्तिष्क और सेल लाइन से पाली एक पूंछ लंबाई का मापन
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Singh, M., Kim, J. H. Measurement of … More

Singh, M., Kim, J. H. Measurement of Poly A Tail Length from Drosophila Larva Brain and Cell Line. J. Vis. Exp. (203), e66116, doi:10.3791/66116 (2024).

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