Summary
Protokollen beskriver en effektiv og pålitelig metode for å kvantifisere poly(A) lengden av genet av interesse fra Drosophila-nervesystemet , som lett kan tilpasses vev eller celletyper fra andre arter.
Abstract
Polyadenylering er en avgjørende posttranskripsjonell modifikasjon som tilfører poly (A) haler til 3'-enden av mRNA-molekyler. Lengden på poly (A) halen er tett regulert av cellulære prosesser. Dysregulering av mRNA-polyadenylering har vært assosiert med unormalt genuttrykk og forskjellige sykdommer, inkludert kreft, nevrologiske lidelser og utviklingsavvik. Derfor er forståelse av dynamikken i polyadenylering avgjørende for å løse kompleksiteten i mRNA-behandling og posttranskripsjonell genregulering.
Denne artikkelen presenterer en metode for måling av poly(A) halelengder i RNA-prøver isolert fra Drosophila larvehjerner og Drosophila Schneider S2-celler. Vi benyttet guanosin / inosin (G / I) tailing tilnærming, som involverer enzymatisk tilsetning av G / I-rester ved 3'-enden av mRNA ved bruk av gjærpoly (A) polymerase. Denne modifikasjonen beskytter RNAs 3'-ende mot enzymatisk nedbrytning. De beskyttede poly(A)-halene i full lengde blir deretter reverstranskribert ved hjelp av en universell antisense-primer. Deretter utføres PCR-amplifisering ved hjelp av en genspesifikk oligo som retter seg mot genet av interesse, sammen med en universell sekvensoligo som brukes til revers transkripsjon.
Dette genererer PCR-produkter som omfatter poly (A) haler av genet av interesse. Siden polyadenylering ikke er en jevn modifikasjon og resulterer i haler av varierende lengde, viser PCR-produktene en rekke størrelser, noe som fører til et smøremønster på agarosegel. Til slutt blir PCR-produktene utsatt for høyoppløselig kapillær gelelektroforese, etterfulgt av kvantifisering ved bruk av størrelsene på poly (A) PCR-produktene og det genspesifikke PCR-produktet. Denne teknikken gir et enkelt og pålitelig verktøy for å analysere poly (A) halelengder, slik at vi kan få dypere innsikt i de intrikate mekanismene som styrer mRNA-regulering.
Introduction
De fleste eukaryote mRNA er posttranskripsjonelt polyadenylert ved deres 3'-endestasjon i kjernen ved tilsetning av ikke-malte adenosiner av kanoniske poly (A) polymeraser. En intakt poly (A) hale er sentral gjennom hele livssyklusen til mRNA, da den er viktig for mRNA kjernefysisk eksport1, letter interaksjon med poly (A) -bindende proteiner for å forbedre translasjonseffektiviteten2, og gir motstand mot nedbrytning3. I visse tilfeller kan poly (A) halen også gjennomgå forlengelse i cytoplasma, tilrettelagt av ikke-kanoniske poly (A) polymeraser4. I cytoplasma endres poly (A) halelengde dynamisk og påvirker levetiden til mRNA-molekylet. Tallrike polymeraser og deadenylaser er kjent for å modulere halelengde 5,6,7. For eksempel korrelerer forkortelsen av poly(A) haler med translasjonsundertrykkelse, mens forlengelsen av poly(A) haler forbedrer oversettelsen 8,9.
Akkumulerende genomiske studier har vist den grunnleggende betydningen av poly (A) halelengden på tvers av ulike fasetter av eukaryot biologi. Dette inkluderer roller i kimcelleutvikling, tidlig embryonal utvikling, neuronal synaptisk plastisitet for læring og minne, og den inflammatoriske responsen10. Det har vært mange metoder og analyser utviklet for måling av poly (A) halelengder. For eksempel utnytter RNase H / oligo (dT) analysen RNase H i nærvær eller fravær av oligo (dT) for å studere poly (A) hale lengde11,12. Andre metoder for å studere poly (A) hale inkluderer PCR-amplifisering av 3' ender som rask amplifisering av cDNA ender poly (A) test (RACE-PAT) 12,13 og ligasemediert poly (A) test (LM-PAT) 14. Ytterligere modifikasjoner av PAT-analysen inkluderer ePAT15 og sPAT16. Enzymatisk G-tailing17,18 eller G/I-tailing av 3'-enden er andre variasjoner av PAT-analysen. Ytterligere modifikasjon av disse teknikkene inkluderer bruk av fluorescerende merkede primere sammen med kapillær gelelektroforese for høyoppløselig analyse, referert til som høyoppløselig poly (A) test (Hire-PAT) 19. Disse PCR-drevne analysene tillater rask og høy følsomhet poly (A) lengdekvantifisering.
Med utviklingen av neste generasjons sekvensering, tillater en høykapasitets sekvenseringsmetode, som PAL-seq20 og TAIL-seq21, polyadenyleringsanalyser i transkriptom-bred skala. Imidlertid gir disse metodene bare korte sekvenseringsavlesninger av 36-51 nukleotider. Derfor ble FLAM-Seq22 utviklet for global halelengdeprofilering av mRNA i full lengde og gir lange avlesninger. Nanopore-teknologi23 gir PCR-uavhengig, direkte RNA eller direkte cDNA-sekvensering for poly (A) halelengdeestimeringer. Imidlertid er disse metodene med høy gjennomstrømning ikke uten begrensninger. De krever store mengder startmaterialer, er dyre og tidkrevende. Videre kan analyse av sjeldne transkripsjoner være ekstremt utfordrende med høy gjennomstrømningsmetoder, og PCR-baserte metoder med lav gjennomstrømning gir fortsatt en fordel når et lite antall transkripsjoner må analyseres, for piloteksperimenter og validering av andre metoder.
Vi har nylig vist at Dscam1 mRNA inneholder korte poly(A) haler i Drosophila, noe som nødvendiggjør en ikke-kanonisk binding av det cytoplasmatiske poly(A)-bindende proteinet på Dscam1 3'UTR ved bruk av G/I-halemetoden24. Her gir vi en strømlinjeformet prosedyre for vevspreparasjon og kvantifisering av poly (A) lengde av mRNA fra Drosophila-nervesystemet og Drosophila S2-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Oppdrett og valg av Drosophila larver
- Vedlikeholde/dyrke fluestammen (w1118, wildtype) på standard fluematmedium ved 25 °C i en fuktet inkubator.
- Velg 10vandrende 3 rd instar larver 72 t etter egglegging.
- Legg larvene i en 35 mm tom petriskål og vask dem forsiktig ved å overføre larvene til den nye tallerkenen med vann fra springen med tang. Gjør dette 2x for å fjerne gjenværende mat.
2. Hjerneisolasjon fra Drosophila-larver (figur 1)
Figur 1 Disseksjon av larvehjernen Drosophila fra 3. (A) Skjematiske tegninger av Drosophila larve. (VG Nett) Larve disseksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Legg 10 larver på et disseksjonsfat som inneholder iskald PBS.
- Plasser larvens ryggside opp (identifisert av trakealrør som løper langs lengden) og fest hver ende til bunnen av fatet etterfulgt av å lage et lite snitt på kroppsveggen i bakre ende.
- Klipp kroppsveggen langs den dorsale midtlinjen mot den fremre enden ved hjelp av mikrodisseksjonsaks.
- Skyll kort det indre av larven ved hjelp av en Pasteur-pipette 3x med PBS i fatet for å eksponere hjernen.
- Finn og løft hjernen ved hjelp av tangen og isoler den forsiktig ved hjelp av mikrodisseksjonssaks.
- Overfør dissekerte hjerner til et 1,5 ml mikrosentrifugerør fylt med iskald PBS på is; samle alle larvhjerner. Fortsett med RNA-ekstraksjon ved hjelp av et RNA-mikroprep-sett som beskrevet i avsnitt 4.
MERK: Gjør en disseksjon av 10 larver innen 15 minutter for å forhindre vevskader og RNA-nedbrytning.
3. Drosophila S2 Schneider-celler
- Vokse Drosophila S2 celler i Drosophila Schneiders medium supplert med 10% føtal bovint serum (FBS) ved 25 ° C i en fuktet inkubator til en tetthet på 8 × 106 til 10 × 106 celler / ml med minimum 90% levedyktighet.
- I et 50 ml sterilt konisk rør, fortynn celler til 2,5 × 106 celler / ml med Schneiders Drosophila medium supplert med 10% FBS som er forvarmet til 25 ° C.
- Overfør 8 ml av cellesuspensjonen (20 × 106 celler) til en 100 mm kulturplate og tilsett 4 ml medium for å gjøre den til 12 ml (dag 1).
- Inkuber de dyrkede cellene ved 25 °C i en fuktet inkubator.
MERK: Cellene fester seg løst til platen etter 12-16 timer (dag 2). - Transfekt cellene med passende DNA-plasmider24.
- Inkubere i 48 timer i en fuktet inkubator.
- Etter inkubering, samle celler ved å legge til 5 ml iskald PBS ved forsiktig pipettering (dag 4).
- Overfør cellene til et 15 ml rør.
- Pellet cellene ved å sentrifugere ved 1000 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Skyll cellene 2x med iskald PBS ved forsiktig pipettering og samle cellene ved å sentrifugere dem ved 1000 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Utfør RNA-ekstraksjon ved hjelp av et RNA miniprep-sett.
MERK: Utfør følgende trinn inne i en steril avtrekk for laminær luftstrøm.
4. Total RNA-ekstraksjon fra Drosophila larver hjerne og S2 celler
- Larvehjerne: Fjern PBS ved kort sentrifugering (8 s kort spinn ved 5000 × g).
- Tilsett 600 μL RNA-lysisbuffer og homogeniser 10x med en plastpestel. Inspiser røret visuelt under et stereomikroskop for å sikre fullstendig lysering.
- Sentrifuge ved 1000 × g i 5 minutter ved 4 °C for å fjerne vevsrester. Overfør den ryddede supernatanten til et nukleasefritt mikrosentrifugerør.
- Isoler RNA ved hjelp av et RNA-mikroprep-sett i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: Bruken av et RNA-mikroprep-sett er viktig for larvens hjerneprøver på grunn av den lille mengden RNA som er tilstede i prøvene. - S2-celler: Fjern PBS og isoler RNA i henhold til produsentens instruksjoner.
- Mål RNA-utbytte og kvalitet ved spektrofotometri og agarosegelelektroforese.
- Bestem renheten og mengden ekstrahert RNA ved å måle den optiske tettheten til det ekstraherte RNA ved henholdsvisA 260 nm og A280 nm. Forsikre deg om at forholdet A260 nm / A280 nm er ≥2,0 og RNA-konsentrasjonen er >350 ng / μL for nedstrøms applikasjoner.
MERK: Et typisk RNA-utbytte fra 10 Drosophila larvehjerner er ~ 500-800 ng / μL eller 2,5-4 μg i 5 μL. For S2-celler er utbyttet ~2-3 μg/μL (15-30 μg i 15 μL). Isolert RNA kan lagres ved -80 °C for langtidslagring.
- Bestem renheten og mengden ekstrahert RNA ved å måle den optiske tettheten til det ekstraherte RNA ved henholdsvisA 260 nm og A280 nm. Forsikre deg om at forholdet A260 nm / A280 nm er ≥2,0 og RNA-konsentrasjonen er >350 ng / μL for nedstrøms applikasjoner.
5. Fremstilling av RNA-gel og elektroforese
- 1,5% Denaturerende RNA-gel (100 ml)
MERK: Formaldehyd er giftig gjennom hudkontakt og innånding av damper; Håndter den i en kjemisk avtrekkshette.- Løs opp tre agarosetabletter (1,5 g) i 82 ml MOPS buffer (tilleggsfil 1) til tablettene brytes helt opp og danner fine partikler.
- Varm agaroseoppslemmingen i en mikrobølgeovn til løsningen er klar og alle partiklene er fullstendig oppløst.
- Avkjøl oppløsningen til ~60 °C.
- Tilsett 18 ml 37% formaldehyd, bland deretter med forsiktig virvling. Hell løsningen i støpebrettet og la den stivne i en avtrekkshette.
- RNA-prøvepreparering og elektroforese
- Fortynn RNA-prøven til 200 ng (i 5 μL) og tilsett 5 μL 2x RNA-lastfargestoff.
- Varm prøvene ved 70 °C i 5 minutter i et tørt bad.
- Last 2 μL RNA-stige i første kjørefelt og 10 μL prøver i tilstøtende baner.
- Utfør elektroforese i MOPS-buffer ved 100 V i 60 minutter for en 5 x 6 cm gel.
MERK: Juster elektroforeseforholdene avhengig av amplikonstørrelsene. - Visualiser gelen på en UV-transilluminator.
MERK: Tilstedeværelsen av et enkeltbånd ~ 600 nukleotidstørrelse indikerer intakt RNA-forberedelse (se figur 2A).
6. Poly (A) hale lengde måling
Figur 2: RNA-prøvepreparering og poly(A)-haleanalysen. (A) RNA-gelbildene viser totalt RNA fra Drosophila larvehjerne (venstre) og S2-celler (høyre) på en 1,5% formaldehydagarosegel. Enkeltstrengede RNA-stigestørrelser er vist i nukleotider på bane M. Legg merke til et stort RNA-bånd på ~ 600 nt, som er fra rRNA. (B) Skjemaer av poly (A) -hale analyse. Forkortelse: G/I = guanosin/inosin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- GI-haling (figur 2B)
- Hold reagensene på is, lag følgende blanding (20 μL): opptil 14 μL total RNA-prøve (1 μg), 4 μL 5x halebufferblanding og 2 μL 10x haleenzymblanding.
- Inkuber ved 37 °C i 60 minutter i en termosyklist.
- Tilsett 1,5 μL av halestoppløsningen; Hold på is i 2 min.
MERK: Fortsett å reversere transkripsjon eller lagre GI-tailed RNA-prøvene ved -80 ° C til du er klar til å fortsette å reversere transkripsjon.
- Revers transkripsjon og PCR-amplifisering
- Syntetiser cDNA ved å forberede blandingen og inkubere den under betingelsene beskrevet i tilleggsfil 1.
- Fortynn cDNA-prøvene og utfør PCR for å amplifisere DNA som angitt i tilleggsfil 1.
7. PCR-produktanalyse ved agarosegelelektroforese
- Analyser en liten del (2-5 μL) av PCR-produktene fra trinn 6.2.2 på en 2,5% agarosegel ved elektroforese ved 100 V i 45 minutter for kvalitetskontroll.
- Bekreft spesifisiteten til PCR for genspesifikke og halespesifikke reaksjoner ved å sekvensere de gelekstraherte PCR-båndene.
8. Kapillær elektroforese
- Utfør høyoppløselig gelelektroforese på 1 μL PCR-produkter (0,5-5 ng / μL) fra genspesifikk og poly (A) -spesifikk PCR ved bruk av bioanalysatoren med et høysensitivt DNA-sett. Se etter veloppløste topper som indikerer et vellykket løp.
9. Dataanalyse: poly (A) halelengdemåling (figur 3)
Figur 3: Poly(A) halelengde og toppverdimåling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Tilgang til data
- For å få tilgang til dataene, åpne xad-filen i programvaren.
- Velg eksempelnavnet eller stigen i trevisningspanelet.
MERK: Dette vil vise resultatet som elektroferogrammer eller gellignende bilder for de valgte prøvene. Den nedre markøren 35 basepar (bp) og øvre markør 10,380 bp er de interne standardene som brukes til å justere stigedataene (50-7,000 bp) med data fra prøvebrønnene. - Zoom inn og ut av elektroferogrammer og gellignende bilder for å vise detaljene.
- Utfører topp- og smøreanalyse
- For å oppnå toppstørrelsene, åpne elektroferogrammet til en valgt prøve.
- Høyreklikk på elektroferogrammet og velg manuell integrasjon for å manuelt velge topper ved å dra den horisontale linjen.
- Vær oppmerksom på toppverdiene i Topp-tabellen. Identifiser toppen med den største topphøyden. Dette er en topp av poly (A) halelengde for en individuell prøve. I eksemplet som vises, er det 346 bp.
- Aktiver Vis / skjul settpunkter ikonet på toppmenyen og vent til et nytt panel dukker opp på høyre side.
- Velg Avansert, bla nedover for å finne Utfør smøreanalyse, og merk av i avmerkingsboksen. Dette vil legge til Region-tabellen i kategorien elektroferogramme.
- Velg et elektroherogram fra en prøve og gå til regiontabellen, som viser menyen Fra [bp] og Til [bp]. For å angi start og slutt [bp], høyreklikk på elektroferogrammet og velg Region for å legge til Legg til region.
- Høyreklikk på en hvilken som helst celle i regiontabellen og velg Endre regioner for å lage et lite nytt vindu der egendefinerte regioner kan angis.
MERK: For eksempel brukte vi et område på 300 bp til 550 bp for GAPDH. Den genspesifikke GAPDH PCR ga en topp på 265 bp. Den universelle primeren (tabell 1) utvider lengden av poly (A) PCR med 35 bp via glødning til G / I-tailed RNA. Dermed starter det første adeninnukleotidet på GAPDH RNA ved 300 bp (265 + 35). Vi begrenset vilkårlig maksimal poly (A) halelengde til 250 (300 + 250 = 550). Fra områdetabellen returnerer programmet gjennomsnittsstørrelsen i regionen som 387 bp. - Bruk ligning (1) for å beregne poly (A) halelengden på mRNA av interesse:
Poly(A) halelengde = (A - B - 35) (1)
Hvor A er gjennomsnittlig bp av poly (A) -spesifikt PCR-produkt fra elektrofherogram (dvs. 387 bp for GAPDH), B er toppen bp av genspesifikt PCR-produkt fra elektrofherogram (dvs. 265 bp for GAPDH), og "35" er lengden på universell omvendt primerkode.
MERK: Fra beregningen ovenfor er gjennomsnittlig poly (A) halelengde på GAPDH 387 - 265 - 35 = 87 bp.
10. Visualisere poly (A) hale lengdefordeling
- Eksportere data som en CSV-fil under Fil | Eksport | Eksempeldata for å hente eksempeldata.
MERK: Den eksporterte csv-filen viser kjøretid i stedet for bp på X-aksen. - Gå til et elektroferoggram av en prøve og sjekk på Vis størrelser på Electropherogram-fanen for automatisk å konvertere regiontabellen på regiontabellen fra bp til kjøretid. I eksemplet tilsvarer 70,39 s til 86,28 s 300 bp til 550 bp.
- Åpne csv-filen og velg verdiene fra 70.39 s til 86.28 s kjøretid for å generere en graf. For å visualisere bp-størrelser til X-aksen på grafen, eksporter elektroferogrammet med bp-størrelser som en bildefil og legg det på grafen som genereres i regnearket. Dette vil passe godt til bp-størrelsene på poly(A) halefordeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her analyserte vi poly(A) halelengden til Dscam1 og GAPDH fra Drosophila larvehjerner (figur 4). Isolerte RNA ble visualisert på en agarosegel for kvalitetskontroll. Et enkelt RNA-bånd på rundt 600 nukleotidstørrelse indikerer intakt RNA-preparat (figur 2A). RNA ble utsatt for G/I-haling og høyoppløselig kapillærelektroforese ved bruk av en Agilent 2100 bioanalysator. Gelbildene ble eksportert ved hjelp av Agilent 2100 Expert Software og satt sammen deretter. PCR-produktene fra GAPDH og Dscam1 genspesifikke primerpar viste et distinkt enkeltbånd, mens de fra de genspesifikke/universelle primerparene viste distinkte smøremønstre (figur 4A og tabell 1), som indikerer differensialpoly(A) lengde av GAPDH og Dscam1 mRNA. I figur 4B ble smøreanalysen brukt for å oppnå gjennomsnittlige poly(A) halelengder fra GAPDH og Dscam1. Elektroferogrammene ble eksportert og modifisert for å representere poly(A) halelengder (figur 4C).
Tilsvarende utførte vi en poly(A) halelengdeanalyse på S2-celler (figur 5). For å bestemme rollen til Dscam1 3'UTR i forkortelse av poly (A) haler, ble S2-celler transfektert med DNA-plasmider som inneholdt Dscam1-kodende region med enten SV40 3'UTR eller Dscam1 3'UTR. Minimum SV40 3'UTR ble valgt for kontroll av Dscam1 3'UTR siden SV40 3'UTR har blitt mye brukt som minimum transkripsjonsterminering og polyadenyleringssignal for rekombinante DNA-plasmider. Totalt RNA ble ekstrahert og utsatt for RT-PCR, G/I-haling og høyoppløselig kapillær elektroforese (figur 5). Resultatet viser at poly(A) halelengdefordelingen fra SV40 3'UTR-plasmidet fulgte et lignende mønster som for endogent GAPDH , mens poly(A) halelengdefordelingen fra Dscam1 3'UTR-plasmidet fulgte et lignende mønster som for endogent Dscam1 mRNA fra larvehjernen.
Figur 4: Poly(A) halelengdemåling av GAPDH og Dscam1 fra larvehjernen. (A) Kapillær gelelektroforese løser det genspesifikke PCR-produktet som et diskret bånd (første og andre baner) for GAPDH2 og Dscam1. PCR-produktet ved bruk av universell omvendt primer viser en smørefordeling (tredje og fjerde kjørefelt). * Ikke-spesifikt bånd. (B) De gjennomsnittlige poly(A)-halelengdene ble beregnet ved hjelp av smøreanalysen. (C) Fordelingen av poly (A) halelengde ble rekonstruert fra den eksporterte csv-filen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Poly (A) halelengdemåling av transfektert Dscam1 DNA-plasmid. Kultivert Drosophila S2 celler ble co-transfected med Dscam1 konstruerer som inneholder koding regionen Dscam1, og 3'UTR av enten Dscam1 eller SV40. (A) Kapillære gelelektroforesebilder vises for det genspesifikke PCR-produktet som et diskret bånd (første og andre baner) for SV40 (Dscam1-SV40 3'UTR) og Dscam1 (Dscam1-Dscam1 3'UTR). PCR-produktet ved bruk av universell omvendt primer viser et smøremønster (tredje og fjerde baner). * Ikke-spesifikt bånd. (B) De gjennomsnittlige poly(A)-halelengdene ble beregnet ved hjelp av smøreanalysen. (C) Poly (A) halelengdefordelingen ble rekonstruert fra den eksporterte csv-filen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Dscam1 |
| Forward Primer (5'-3') CGCAGCCACAACAATTGAATG |
| Omvendt primer (5'-3') AAATAAAATCAAATCATATATTTAGCAACTTATGAAC |
| SV40 |
| Forward Primer (5'-3') CCACAAAGGAAAAAGCTGCAC |
| Omvendt primer (5'-3') TTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTG |
| GAPDH |
| Forward Primer (5'-3') CACTTCAGAAACGGCCTGAAAATGGC |
| Omvendt primer (5'-3') AATATTTAAATGCTTATGAGTCGGCATTTTTAAAACTAC |
| Universell omvendt primer |
| Omvendt primer (5'-3') GGTAATACGACTCACTATAGCGAGACCCCCCCCCCTT |
Tabell 1: Primere brukt i denne protokollen.
Tilleggsfil 1: Sammensetning av løsninger og PCR-oppsett. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen beskriver vi teknikken for å dissekere Drosophila larvehjernen fravandrende 3. stjernestadium samt prøveprepareringen fra Drosophila S2-celler. På grunn av mRNAs labile natur krever prøveinnsamling ekstra forsiktighet. Ved hjernedisseksjon av larver skal hjernen ikke skades under isolasjon og ikke oppbevares i oppløsning over lengre tid. Å holde disseksjonstiden til 8-10 min for en runde med disseksjon er viktig. Det kan også være fordelaktig å supplere disseksjonsløsningen med RNAase-hemmere. Når det gjelder S2-celledyrking og transfeksjon, utfør alle trinnene i den laminære strømningshetten.
RNA-isolasjonstrinnet krever ytterligere vurdering. Vi anbefaler å bruke et rent rom av laminær strømningstype som er forbehandlet med RNase-fjerningsløsninger. Bortsett fra RNA-utbytte, er det viktig å kontrollere RNA-integriteten for å sikre at prøven ikke har blitt degradert under disseksjons- og isolasjonstrinnene. RNA-integritet kan visualiseres ved denaturering av agarosegelelektroforese. Det totale RNA fra Drosophila viser en enkelt båndprofil fordi 28S rRNA er dissosiert i to like store underenheter, som comigrates med 18S rRNA25. Dette kan sees som et enkelt bånd på rundt 600 nukleotider ved bruk av en enkeltstrenget RNA-stige (figur 2A).
Isolerte RNA-prøver utsettes for G/I-haling (figur 2B). Guanosin- og inosinrester tilsettes ved 3'-enden av RNA av gjærpoly (A) polymerase (PAP) 17, som bevarer 3'-enden av RNA fra enzymatisk nedbrytning. De nylig syntetiserte G / I-tag-beskyttede RNAene i full lengde er reverstranskribert for å gi cDNA-prøver ved bruk av universell omvendt primer (3'-merket C10T2). Etterfulgt av en PCR med genspesifikke fremover / revers primere rett oppstrøms for polyadenyleringsstedet for å generere et PCR-produkt som viser et skarpt bånd. PCR-reaksjonene fra en genspesifikk fremover og de universelle omvendte primerne genererer udefinerte lengder av DNA-molekyler som et smør på gelen, som reflekterer varierende lengder av poly (A) haler. PCR-produktene ble deretter analysert ved kapillær gelelektroforese.
Ved utforming av primere er det viktig å merke seg at amplikonstørrelsen med genspesifikke forover/bakoverprimere bør ligge i området 50-300 bp. Testing av flere fremre primere gir en mulighet til å finne den beste primeren som fungerer for poly (A) halevurdering. Vi anbefaler å designe en omvendt primer for genspesifikke produkter like oppstrøms for det forutsagte poly (A) startstedet fordi dette gir en mulighet for enkel beregning av poly (A) halelengder. Ved kjøring av PCR-reaksjoner er det viktig å utføre en "ingen revers transkriptasekontroll" for å utelukke amplifisering fra forurenset genomisk DNA. PCR-optimalisering med glødningstemperaturgradient anbefales på det sterkeste. Gitt arten av denne metodikken, krever analyse av poly (A) halelengder av alternativt polyadenylerte mRNA-arter ytterligere vurdering. For eksempel gjennomgår mange gener alternativ polyadenylering for å generere forskjellige 3'UTR-arter26. Vi anbefaler å bruke forskjellige PCR-primersett for å studere individuelle 3'UTR-arter.
Vi anbefaler på det sterkeste å inkludere det genspesifikke PCR-produktet på kapillær gelelektroforese i hver kjøring, siden det er en potensiell migrasjonsforskjell på noen få nukleotider i hver kjøring. Det er viktig at den faktiske baseparstørrelsen til den genspesifikke PCR brukes i stedet for de teoretiske størrelsene ved beregning av poly (A) halelengde.
Noen RNA gjennomgår ytterligere posttranskripsjonelle modifikasjoner, inkludert terminal uridylering27. G/I-halemetoden er kanskje ikke egnet til å måle poly(A) halelengde når mRNA-et er uridylert. Dette skyldes at den universelle omvendte primeren kanskje ikke effektivt forsterker mRNA-artene som har ikke-adeninnukleotider ved sin 3'-ende. G/I-halingen er en PCR-basert metode, som potensielt skaper uønsket skjevhet ved å forsterke kortere fragmenter mer effektivt. Dermed bør brukerne være forsiktige når de tolker resultatet.
Ved hjelp av metoden som presenteres her, demonstrerte vi at G / I-halen effektivt kan brukes til å måle poly (A) halelengde fra Drosophila-nervesystemet og S2-celler. Metoden er svært kvantitativ når den kombineres med kapillær elektroforese. Mens analyser med høy gjennomstrømning gir global poly(A) haleanalyse, er den PCR-baserte metoden G/I-tailing fortsatt svært nyttig for enkelttranskripsjonsanalyse, piloteksperimenter og validering av andre metoder. Oppsummert avhenger valg av metode av de konkrete forskningsspørsmålene og målene. Forskeren bør velge den metoden som passer best til deres eksperimentelle behov og ressurser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av National Institute of Neurological Disorders and Stroke Grant R01NS116463 til JK, og Cellular and Molecular Imaging Core-anlegget ved University of Nevada, Reno, som ble støttet av National Institutes of Health Grant P20GM103650 og brukt til forskning rapportert i denne studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Research Product Internation (RPI) | M92020 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Agilent software 2100 expert free download demo | Agilent Technologies | https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259 | |
| Apex 100 bp-Low DNA Ladder | Genesee Scientific | 19-109 | |
| Bioanalyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C | ||
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Research Product Internation (RPI) | D43060 | |
| DNA dye (Gel Loading Dye, Purple (6x) | New England biolabs | B7024S | |
| Drosophila S2 cell line | Drosophila Genomics Resource Center stock #181 | ||
| Drosophila Schneider’s Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| Ehidium bromide | Genesee scientific | 20-276 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Forceps Dumont 5 | Fine Science tools | 11254-20 | |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| PBS 10x | Research Product Internation (RPI) | P32200 | |
| Poly(A) Tail-Length Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 764551KT | |
| RiboRuler Low Range RNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | SM1833 | |
| RNA Gel Loading Dye (2x) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | |
| RNA microprep kit | Zymoresearch | R1050 | |
| RNA miniprep kit | Zymoresearch | R1055 | |
| Scissors-Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science tools | 15000-08 | |
| TopVision Agarose Tablets | Thermo Fisher Scientific | R2802 | |
| Tris-Acetate-EDTA (TAE) | Thermo Fisher Scientific | B49 |
References
- Stewart, M. Polyadenylation and nuclear export of mRNAs. Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 2977-2987 (2019).
- Machida, K., et al. Dynamic interaction of poly(A)-binding protein with the ribosome. Scientific Reports. 8 (1), 17435 (2018).
- Eisen, T. J., et al. The dynamics of cytoplasmic mRNA metabolism. Molecular Cell. 77 (4), 786-799 (2020).
- Liudkovska, V., Dziembowski, A. Functions and mechanisms of RNA tailing by metazoan terminal nucleotidyltransferases. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 12 (2), e1622 (2021).
- Goldstrohm, A. C., Wickens, M. Multifunctional deadenylase complexes diversify mRNA control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (4), 337-344 (2008).
- Schmidt, M. J., Norbury, C. J. Polyadenylation and beyond: emerging roles for noncanonical poly(A) polymerases. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 1 (1), 142-151 (2010).
- Laishram, R. S. Poly(A) polymerase (PAP) diversity in gene expression - Star-PAP vs canonical PAP. FEBS Letters. 588 (14), 2185-2197 (2014).
- Salles, F. J., Lieberfarb, M. E., Wreden, C., Gergen, J. P., Strickland, S. Coordinate initiation of Drosophila development by regulated polyadenylation of maternal messenger RNAs. Science. 266 (5193), 1996-1999 (1994).
- Wreden, C., Verrotti, A. C., Schisa, J. A., Lieberfarb, M. E., Strickland, S. Nanos and pumilio establish embryonic polarity in Drosophila by promoting posterior deadenylation of hunchback mRNA. Development. 124 (15), 3015-3023 (1997).
- Passmore, L. A., Coller, J. Roles of mRNA poly(A) tails in regulation of eukaryotic gene expression. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (2), 93-106 (2021).
- Murray, E. L., Schoenberg, D. R. Assays for determining poly(a) tail length and the polarity of mRNA decay in mammalian cells. Methods in Enzymology. 448, 483-504 (2008).
- Salles, F. J., Strickland, S. Analysis of poly(a) tail lengths by PCR: The PAT assay. Methods in Molecular Biology. 118, 441-448 (1999).
- Salles, F. J., Darrow, A. L., O'Connell, M. L., Strickland, S. Isolation of novel murine maternal mRNAs regulated by cytoplasmic polyadenylation. Genes and Development. 6 (7), 1202-1212 (1992).
- Salles, F. J., Strickland, S. Rapid and sensitive analysis of mRNA polyadenylation states by PCR. Genome Research. 4 (6), 317-321 (1995).
- Janicke, A., Vancuylenberg, J., Boag, P. R., Traven, A., Beilharz, T. H. ePAT: A simple method to tag adenylated RNA to measure poly(a)-tail length and other 3' RACE applications. RNA. 18 (6), 1289-1295 (2012).
- Minasaki, R., Rudel, D., Eckmann, C. R. Increased sensitivity and accuracy of a single-stranded DNA splint-mediated ligation assay (sPAT) reveals poly(a) tail length dynamics of developmentally regulated mRNAs. RNA Biology. 11 (2), 111-123 (2014).
- Martin, G., Keller, W. Tailing and 3'-end labeling of RNA with yeast poly(A) polymerase and various nucleotides. RNA. 4 (2), 226-230 (1998).
- Kusov, Y. Y., Shatirishvili, G., Dzagurov, G., Verena, G. M. A new G-tailing method for the determination of the poly(a) tail length applied to hepatitis a virus RNA. Nucleic Acids Research. 29 (12), 57 (2001).
- Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
- Subtelny, A. O., Eichhorn, S. W., Chen, G. R., Sive, H., Bartel, D. P. Poly(a)-tail profiling reveals an embryonic switch in translational control. Nature. 508 (1), 66-71 (2014).
- Chang, H., Lim, J., Ha, M., Kim, V. N. TAIL-seq: Genome-wide determination of poly(a) tail length and 3' end modifications. Molecular Cell. 53 (6), 1044-1052 (2014).
- Legnini, I., Alles, J., Karaiskos, N., Ayoub, S., Rajewsky, N. FLAM-seq: Full-length mRNA sequencing reveals principles of poly(A) tail length control. Nature Methods. 16 (9), 879-886 (2019).
- Garalde, D. R., et al. Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores. Nature Methods. 15 (3), 201-206 (2018).
- Singh, M., Ye, B., Kim, J. H. Dual leucine zipper kinase regulates Dscam expression through a noncanonical function of the cytoplasmic poly(A)-binding protein. Journal of Neuroscience. 42 (31), 6007-6019 (2022).
- Macharia, R. W., Ombura, F. L., Aroko, E. O. Insects' RNA profiling reveals absence of "hidden break" in 28S ribosomal RNA molecule of onion thrips, Thrips tabaci. Journal of Nucleic Acids. 2015, 965294 (2015).
- Miura, P., Sanfilippo, P., Shenker, S., Lai, E. C. Alternative polyadenylation in the nervous system: to what lengths will 3' UTR extensions take us. Bioessays. 36 (8), 766-777 (2014).
- Sement, F. M., et al. et al Uridylation prevents 3' trimming of oligoadenylated mRNAs. Nucleic Acids Research. 41 (14), 7115-7127 (2013).
