Summary
Protokollet beskriver en effektiv och tillförlitlig metod för att kvantifiera poly(A)-längden på genen av intresse från nervsystemet Drosophila , som lätt kan anpassas till vävnader eller celltyper från andra arter.
Abstract
Polyadenylering är en avgörande posttranskriptionell modifiering som lägger till poly(A)-svansar till 3'-änden av mRNA-molekyler. Längden på poly(A)-svansen är hårt reglerad av cellulära processer. Dysreglering av mRNA-polyadenylering har associerats med onormalt genuttryck och olika sjukdomar, inklusive cancer, neurologiska störningar och utvecklingsavvikelser. Därför är det viktigt att förstå dynamiken i polyadenylering för att reda ut komplexiteten i mRNA-bearbetning och posttranskriptionell genreglering.
Denna artikel presenterar en metod för att mäta poly(A) svanslängder i RNA-prover isolerade från Drosophila-larvhjärnor och Drosophila Schneider S2-celler. Vi använde guanosin/inosin (G/I) tailing-metoden, som innebär enzymatisk tillsats av G/I-rester i 3'-änden av mRNA med hjälp av jästpoly(A)-polymeras. Denna modifiering skyddar RNA:s 3'-ände från enzymatisk nedbrytning. De skyddade poly(A)-svansarna i full längd transkriberas sedan omvänt med hjälp av en universell antisensprimer. Därefter utförs PCR-amplifiering med hjälp av en genspecifik oligo som riktar sig mot genen av intresse, tillsammans med en universell sekvensoligo som används för omvänd transkription.
Detta genererar PCR-produkter som omfattar poly(A)-svansarna av genen av intresse. Eftersom polyadenylering inte är en enhetlig modifiering och resulterar i svansar av varierande längd, uppvisar PCR-produkterna en rad olika storlekar, vilket leder till ett utstryksmönster på agarosgel. Slutligen utsätts PCR-produkterna för högupplösande kapillärgelelektrofores, följt av kvantifiering med hjälp av storleken på poly(A) PCR-produkterna och den genspecifika PCR-produkten. Denna teknik erbjuder ett enkelt och tillförlitligt verktyg för att analysera poly(A)-svanslängder, vilket gör det möjligt för oss att få djupare insikter i de intrikata mekanismerna som styr mRNA-reglering.
Introduction
De flesta eukaryota mRNA polyadenyleras posttranscriptionellt vid sin 3′-terminal i kärnan genom tillsats av icke-mallade adenosiner av kanoniska poly(A)-polymeraser. En intakt poly(A)-svans är avgörande under mRNA:s hela livscykel, eftersom den är avgörande för mRNA-kärnexport1, underlättar interaktion med poly(A)-bindande proteiner för att förbättra translationseffektiviteten2 och ger resistens mot nedbrytning3. I vissa fall kan poly(A)-svansen också genomgå förlängning i cytoplasman, vilket underlättas av icke-kanoniska poly(A)-polymeraser4. I cytoplasman förändras poly (A) svanslängden dynamiskt och påverkar mRNA-molekylens livslängd. Många polymeraser och deadenylaser är kända för att modulera svanslängden 5,6,7. Till exempel korrelerar förkortningen av poly(A)-svansar med translationell repression, medan förlängningen av poly(A)-svansar förbättrar translationen 8,9.
Ackumulerande genomiska studier har visat den grundläggande betydelsen av poly(A)-svanslängden över olika aspekter av eukaryot biologi. Detta inkluderar roller i könscellsutveckling, tidig embryonal utveckling, neuronal synaptisk plasticitet för inlärning och minne och det inflammatoriska svaret10. Det har utvecklats många metoder och analyser för att mäta poly(A) svanslängder. Till exempel utnyttjar RNas H/oligo(dT)-analysen RNas H i närvaro eller frånvaro av oligo(dT) för att studera poly(A) svanslängd11,12. Andra metoder för att studera poly(A)-svans inkluderar PCR-amplifiering av 3'-ändar, såsom snabb amplifiering av cDNA-ändar, poly(A)-test (RACE-PAT)12,13 och ligasmedierat poly(A)-test (LM-PAT)14. Ytterligare modifieringar av PAT-analysen inkluderar ePAT15 och sPAT16. Enzymatisk G-tailing17,18 eller G/I-tailing av 3'-änden är andra varianter av PAT-analysen. Ytterligare modifiering av dessa tekniker inkluderar användning av fluorescerande märkta primers tillsammans med kapillärgelelektrofores för högupplösande analys, kallat högupplöst poly(A)-test (Hire-PAT)19. Dessa PCR-drivna analyser möjliggör snabb och högkänslig kvantifiering av poly(A)-längd.
I och med utvecklingen av nästa generations sekvensering möjliggör en sekvenseringsmetod med hög genomströmning, såsom PAL-seq20 och TAIL-seq21, polyadenyleringsanalyser i transkriptomomfattande skala. Dessa metoder ger dock endast korta sekvenseringsavläsningar av 36-51 nukleotider. Därför utvecklades FLAM-Seq22 för global svanslängdsprofilering av mRNA i full längd och ger långa läsningar. Nanopore-teknik23 ger PCR-oberoende, direkt RNA eller direkt cDNA-sekvensering för uppskattningar av poly(A) svanslängd. Dessa metoder med högt dataflöde är dock inte utan begränsningar. De kräver stora mängder utgångsmaterial, är dyra och tidskrävande. Dessutom kan det vara extremt utmanande att analysera sällsynta transkriptioner med metoder med hög genomströmning, och PCR-baserade metoder med låg genomströmning ger fortfarande en fördel när ett litet antal transkript behöver analyseras, för pilotexperiment och validering av andra metoder.
Vi har nyligen visat att Dscam1 mRNA innehåller korta poly(A)-svansar i Drosophila, vilket kräver en icke-kanonisk bindning av det cytoplasmatiska poly(A)-bindande proteinet på Dscam1 3'UTR med hjälp av G/I-tailing-metoden24. Här tillhandahåller vi en strömlinjeformad procedur för vävnadspreparation och kvantifiering av poly(A)-längden av mRNA från Drosophila-nervsystemet och Drosophila S2-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Uppfödning och urval av Drosophila-larver
- Behåll/odla flugstammen (w1118, vildtyp) på ett vanligt flugfodermedium vid 25 °C i en fuktad inkubator.
- Välj ut 10 vandrande 3:e stjärnlarver 72 timmar efter äggläggning.
- Lägg larverna i en 35 mm tom petriskål och tvätta dem försiktigt genom att överföra larverna till den nya skålen med kranvatten med hjälp av en pincett. Gör detta 2x för att ta bort eventuell kvarvarande mat.
2. Hjärnisolering från Drosophila-larver (figur 1)
Figur 1: Dissektion av Drosophila-larvens hjärna från 3:e stjärnvandringsstadiet. (A) Schematiska ritningar av Drosophila-larven. (B-G) Dissektion av larver. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Lägg 10 larver på en dissektionsskål som innehåller iskall PBS.
- Placera larven med ryggsidan uppåt (identifieras av trakealtuber som löper längs dess längd) och nåla fast varje ände i botten av skålen följt av att göra ett litet snitt på kroppsväggen i den bakre änden.
- Klipp av kroppsväggen längs den dorsala mittlinjen mot den främre änden med hjälp av en mikrodissektionssax.
- Spola larvens inre kort med en Pasteurpipett 3x med PBS i skålen för att exponera hjärnan.
- Lokalisera och lyft hjärnan med hjälp av pincetten och isolera den försiktigt med hjälp av mikrodissektionssax.
- Överför de dissekerade hjärnorna till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör fyllt med iskall PBS på is; Samla in alla larvhjärnor. Fortsätt med RNA-extraktion med hjälp av ett RNA-mikroprep-kit enligt beskrivningen i avsnitt 4.
OBS: Gör en dissektion av 10 larver inom 15 minuter för att förhindra vävnadsskador och RNA-nedbrytning.
3. Drosophila S2 Schneider-celler
- Odla Drosophila S2-celler i Drosophila Schneiders medium kompletterat med 10 % fetalt bovint serum (FBS) vid 25 °C i en befuktad inkubator till en densitet av 8 × 106 till 10 × 106 celler/ml med minst 90 % viabilitet.
- I ett 50 ml sterilt koniskt rör, späd cellerna till 2,5 × 106 celler/ml med Schneiders Drosophila-medium kompletterat med 10 % FBS som har förvärmts till 25 °C.
- Överför 8 ml av cellsuspensionen (20 × 106 celler) till en 100 mm odlingsplatta och tillsätt 4 ml medium så att det blir 12 ml (dag 1).
- Inkubera de odlade cellerna vid 25 °C i en fuktad inkubator.
OBS: Cellerna fäster löst på plattan efter 12-16 timmar (dag 2). - Transfektera cellerna med lämpliga DNA-plasmider24.
- Inkubera i 48 timmar i en befuktad inkubator.
- Efter inkubationen, samla in celler genom att tillsätta 5 ml iskall PBS genom försiktig pipettering (dag 4).
- Överför cellerna till ett 15 ml rör.
- Pelletera cellerna genom centrifugering vid 1 000 × g i 5 minuter vid 4 °C.
- Skölj cellerna 2 gånger med iskall PBS genom att försiktigt pipettera och samla upp cellerna genom att centrifugera dem vid 1 000 × g i 5 minuter vid 4 °C.
- Utför RNA-extraktion med hjälp av ett RNA-miniprep-kit.
OBS: Utför följande steg inuti en steril huv med laminärt flöde.
4. Total RNA-extraktion från Drosophila-larver, hjärna och S2-celler
- Larvens hjärna: Ta bort PBS genom kort centrifugering (8 s kort centrifugering vid 5 000 × g).
- Tillsätt 600 μL RNA-lysbuffert och homogenisera 10 gånger med en plaststöt. Inspektera röret visuellt under ett stereomikroskop för att säkerställa fullständig lys.
- Centrifugera vid 1 000 × g i 5 minuter vid 4 °C för att avlägsna vävnadsrester. Överför den rensade supernatanten till ett nukleasfritt mikrocentrifugrör.
- Isolera RNA med hjälp av ett RNA-mikroprep-kit enligt tillverkarens instruktioner.
OBS: Användningen av ett RNA-mikroprep-kit är viktigt för larvhjärnproverna på grund av den lilla mängden RNA som finns i proverna. - S2-celler: Ta bort PBS och isolera RNA enligt tillverkarens instruktioner.
- Mät RNA-utbyte och kvalitet med spektrofotometri och agarosgelelektrofores.
- Bestäm renheten och kvantiteten av extraherat RNA genom att mäta den optiska densiteten hos det extraherade RNA:t vid A260 nm respektive A280 nm. Se till att förhållandet mellan A260 nm/A280 nm är ≥2,0 och att RNA-koncentrationen är >350 ng/μL för nedströmsapplikationer.
OBS: Ett typiskt RNA-utbyte från 10 Drosophila-larvhjärnor är ~500-800 ng/μL eller 2,5-4 μg i 5 μL. För S2-celler är utbytet ~2-3 μg/μL (15-30 μg i 15 μL). Isolerat RNA kan förvaras vid -80 °C för långtidsförvaring.
- Bestäm renheten och kvantiteten av extraherat RNA genom att mäta den optiska densiteten hos det extraherade RNA:t vid A260 nm respektive A280 nm. Se till att förhållandet mellan A260 nm/A280 nm är ≥2,0 och att RNA-koncentrationen är >350 ng/μL för nedströmsapplikationer.
5. Beredning av RNA-gel och elektrofores
- 1,5 % denaturerande RNA-gel (100 ml)
OBS: Formaldehyd är giftigt genom hudkontakt och inandning av ångor; Hantera den i ett kemiskt dragskåp.- Lös upp tre agarostabletter (1,5 g) i 82 ml MOPS-buffert (kompletterande fil 1) tills tabletterna bryts sönder helt och bildar fina partiklar.
- Värm agarosuppslamningen i mikrovågsugn tills lösningen är klar och alla partiklar är helt upplösta.
- Kyl lösningen till ~60 °C.
- Tillsätt 18 ml 37 % formaldehyd och blanda sedan genom att snurra försiktigt. Häll lösningen i gjutplåten och låt den stelna i ett dragskåp.
- Beredning av RNA-prov och elektrofores
- Späd RNA-provet till 200 ng (i 5 μL) och tillsätt 5 μL 2x RNA-laddningsfärgämne.
- Värm proverna vid 70 °C i 5 minuter i ett torrt bad.
- Ladda 2 μL RNA-stege i den första banan och 10 μL prover i de intilliggande banorna.
- Utför elektrofores i MOPS-buffert vid 100 V i 60 minuter för en 5 x 6 cm gel.
OBS: Justera elektroforesförhållandena beroende på amplikonstorlekar. - Visualisera gelen på en UV-transilluminator.
OBS: Närvaron av ett enda band ~600 nukleotidstorlek indikerar intakt RNA-beredning (se figur 2A).
6. Mätning av poly(A) svanslängd
Figur 2: Beredning av RNA-prov och poly(A)-svansanalys. (A) RNA-gelbilderna visar totalt RNA från Drosophila-larvhjärnan (vänster) och S2-cellerna (höger) på en 1,5-procentig formaldehyd-agarosgel. Enkelsträngade RNA-stegstorlekar visas i nukleotider på bana M. Notera en större RNA-bandning vid ~600 nt, vilket är från rRNA. (B) Schematisk analys av poly(A)-svansanalys. Förkortning: G/I = guanosin/inosin. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- GI-anrikningsverk (figur 2B)
- Håll reagenserna på is och förbered följande blandning (20 μL): upp till 14 μL totalt RNA-prov (1 μg), 4 μL 5x svansbuffertblandning och 2 μL 10x svansenzymblandning.
- Inkubera vid 37 °C i 60 minuter i en termocykler.
- Tillsätt 1,5 μl av lösningen med stjärtstopp. Håll på isen i 2 min.
OBS: Fortsätt med omvänd transkription eller förvara GI-svansade RNA-prover vid -80 °C tills du är redo att fortsätta med omvänd transkription.
- Omvänd transkription och PCR-amplifiering
- Syntetisera cDNA genom att bereda blandningen och inkubera den under de förhållanden som beskrivs i Supplemental File 1.
- Späd ut cDNA-proverna och utför PCR för att amplifiera DNA enligt anvisningarna i kompletterande fil 1.
7. PCR-produktanalys med agarosgelelektrofores
- Analysera en liten del (2-5 μL) av PCR-produkterna från steg 6.2.2 på en 2,5% agarosgel genom elektrofores vid 100 V i 45 min för kvalitetskontroll.
- Verifiera specificiteten hos PCR för genspecifika och svansspecifika reaktioner genom sekvensering av de gelextraherade PCR-banden.
8. Kapillär elektrofores
- Utför högupplösande gelelektrofores på 1 μL PCR-produkter (0,5-5 ng/μL) från genspecifik och poly(A)-specifik PCR med hjälp av bioanalysatorn med ett högkänsligt DNA-kit. Leta efter välupplösta toppar som indikerar en lyckad körning.
9. Dataanalys: poly(A) mätning av svanslängd (figur 3)
Figur 3: Poly(A) svanslängd och toppvärdesmätning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Åtkomst till data
- För att komma åt data, öppna xad-filen i programvaran.
- Välj exempelnamnet eller stegen i trädvypanelen.
OBS: Detta kommer att visa resultatet som elektroferogram eller gelliknande bilder för de valda samples. Det nedre basparet 35 (bp) och den övre markören 10 380 bp är de interna standarder som används för att anpassa stegdata (50-7 000 bp) till data från provbrunnarna. - Zooma in och ut i elektroferogrammen och gelliknande bilder för att visa detaljerna.
- Utföra topp- och utstryksanalys
- För att få toppstorlekarna, öppna elektroferogrammet för ett valt sample.
- Högerklicka på elektroferogrammet och välj manuell integration för att manuellt välja toppar genom att dra den horisontella linjen.
- Observera toppvärdena i tabellen Topp. Identifiera toppen med den största topphöjden. Detta är en topp av poly(A) svanslängd för ett enskilt prov. I exemplet som visas är det 346 bp.
- Aktivera ikonen Visa/dölj börvärden i toppmenyn och vänta på att en ny panel dyker upp på höger sida.
- Välj Avancerat, bläddra nedåt för att hitta Utför utsmetningsanalys och markera kryssrutan. Detta kommer att lägga till regiontabellen på elektroferogramfliken.
- Välj ett elektroferogram från ett prov och gå till tabellen Region, som visar menyn Från [bp] och Till [bp]. För att ställa in start och slut [bp], högerklicka på elektroferogrammet och välj Region för att lägga till Lägg till region.
- Högerklicka på valfri cell i tabellen Region och välj Ändra regioner för att få ett litet nytt fönster att dyka upp där anpassade regioner kan ställas in.
OBS: Till exempel använde vi en region på 300 bp till 550 bp för GAPDH. Den genspecifika GAPDH PCR gav en topp på 265 bp. Den universella primern (tabell 1) förlänger längden på poly(A) PCR med 35 bp via glödgning till G/I-svansade RNA. Således börjar den första adeninnukleotiden på GAPDH RNA vid 300 bp (265 + 35). Vi begränsade godtyckligt den maximala poly(A) svanslängden till 250 (300 + 250 = 550). Från regiontabellen returnerar programmet den genomsnittliga storleken inom regionen som 387 bp. - Använd ekvation (1) för att beräkna poly(A)-svanslängden på det mRNA som är av intresse:
Poly(A) svanslängd = (A - B - 35) (1)
Där A är det genomsnittliga bp för poly(A)-specifik PCR-produkt från elektroferogram (dvs. 387 bp för GAPDH), B är det högsta bp för genspecifik PCR-produkt från elektroferogram (dvs. 265 bp för GAPDH), och "35" är längden på universell omvänd primertagg.
OBS: Från beräkningen ovan är den genomsnittliga poly(A) svanslängden för GAPDH 387 - 265 - 35 = 87 bp.
10. Visualisering av poly(A) svanslängdsfördelning
- Exportera data som en csv-fil under Arkiv | Exportera | Exempeldata för att hämta exempeldata.
Den exporterade csv-filen visar körtid i stället för bp på X-axeln. - Gå till ett elektroferogram av ett prov och kontrollera Visa storlekar på fliken Elektroferogram för att automatiskt konvertera regiontabellen på regiontabellen från bp till körtid. I exemplet motsvarar 70,39 s till 86,28 s 300 bp till 550 bp.
- Öppna csv-filen och välj värden från 70,39 s till 86,28 s körtid för att generera ett diagram. Om du vill visualisera bp-storlekar till X-axeln i diagrammet exporterar du elektroferogrammet med bp-storlekar som en bildfil och lägger över det på grafen som genereras i kalkylbladet. Detta kommer att matcha bp-storlekarna på poly(A)-svansfördelningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här analyserade vi poly(A) svanslängden för Dscam1 och GAPDH från Drosophila-larvhjärnor (Figur 4). Isolerade RNA visualiserades på en agarosgel för kvalitetskontroll. Ett enda RNA-band med en nukleotidstorlek på cirka 600 indikerar intakt RNA-beredning (figur 2A). RNA utsattes för G/I-svansning och högupplöst kapillärelektrofores med hjälp av en Agilent 2100 bioanalysator. Gelbilderna exporterades med hjälp av programvaran Agilent 2100 Expert och monterades därefter. PCR-produkterna från GAPDH och Dscam1 genspecifika primerpar visade ett distinkt enkelband medan de från de genspecifika/universella primerparen visade distinkta utstryksmönster (Figur 4A och Tabell 1), vilket indikerar differentiell poly(A)-längd för GAPDH och Dscam1 mRNA. I figur 4B användes utstryksanalysen för att få fram genomsnittliga poly(A) svanslängder från GAPDH och Dscam1. Elektroferogrammen exporterades och modifierades för att representera poly(A)-svanslängderna (figur 4C).
På samma sätt utförde vi en poly(A) svanslängdsanalys på S2-celler (figur 5). För att bestämma rollen av Dscam1 3'UTR i förkortning av poly(A) svansar, transfekterades S2-celler med DNA-plasmiderna innehållande Dscam1 kodande region med antingen SV40 3'UTR eller Dscam1 3'UTR. Minimum SV40 3'UTR valdes för kontroll av Dscam1 3'UTR eftersom SV40 3'UTR har använts i stor utsträckning som en minimal transkriptionsavslutning och polyadenyleringssignal för rekombinanta DNA-plasmider. Totalt RNA extraherades och utsattes för RT-PCR, G/I-svansning och högupplösande kapillärelektrofores (Figur 5). Resultatet visar att poly(A)-svanslängdsfördelningen från SV40 3'UTR-plasmiden följde ett liknande mönster som den för endogent GAPDH medan poly(A)-svanslängdsfördelningen från Dscam1 3'UTR-plasmiden följde ett liknande mönster som för endogent Dscam1-mRNA från larvhjärnorna.
Figur 4: Poly(A) svanslängdsmätning av GAPDH och Dscam1 från larvernas hjärnor. (A) Kapillärgelelektrofores löser upp den genspecifika PCR-produkten som ett diskret band (första och andra körfälten) för GAPDH2 och Dscam1. PCR-produkten som använder universell omvänd primer visar en utstryksfördelning (tredje och fjärde körfältet). * Icke-specifikt band. (B) De genomsnittliga längderna på poly(A)-svansen beräknades med hjälp av utstryksanalysen. (C) Fördelningen av poly(A)-svanslängden rekonstruerades från den exporterade csv-filen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Poly(A) svanslängdsmätning av transfekterad Dscam1 DNA-plasmid. Odlade Drosophila S2-celler samtransfekterades med Dscam1-konstruktionerna som innehåller den kodande regionen för Dscam1 och 3′UTR för antingen Dscam1 eller SV40. (A) Kapillärgelelektroforesbilder visas för den genspecifika PCR-produkten som ett diskret band (första och andra körfältet) för SV40 (Dscam1-SV40 3'UTR) och Dscam1 (Dscam1-Dscam1 3'UTR). PCR-produkten som använder universell omvänd primer visar ett utstryksmönster (tredje och fjärde körfältet). * Icke-specifikt band. (B) De genomsnittliga längderna på poly(A)-svansen beräknades med hjälp av utstryksanalysen. (C) Poly(A)-svanslängdsfördelningen rekonstruerades från den exporterade csv-filen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Dscam1 |
| Primer framåt (5'-3') CGCAGCCACAACAATTGAATG |
| Omvänd primer (5'-3') AAATAAAATCAAAATCATATATTTAGCAACTTATGAAC |
| SV40 |
| Primer framåt (5'-3') CCACAAAGGAAAAAGCTGCAC |
| Omvänd primer (5'-3') TTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTTTTTTG |
| GAPDH |
| Framåtriktad primer (5'-3') CACTTCAGAAACGGCCTGAAAATGGC |
| Omvänd primer (5'-3') AATATTTAAATGCTTATGAGTCGGCATTTTTAAAACTAC |
| Universell omvänd primer |
| Omvänd primer (5'-3') GGTAATACGACTCACTATAGCGAGACCCCCCCCCCTT |
Tabell 1: Primers som används i detta protokoll.
Tilläggsfil 1: Sammansättning av lösningar och PCR-inställning. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll beskriver vi tekniken för att dissekera Drosophila-larvens hjärna från vandrande 3:e stjärnstadiet samt provberedningen från Drosophila S2-celler. På grund av mRNA:s labila natur kräver provtagning extra försiktighet. Vid dissektion av larvhjärnan ska hjärnan inte skadas under isoleringen och ska inte hållas i lösning under en längre tid. Det är viktigt att hålla dissektionstiden till 8-10 minuter för en dissektionsrunda. Det kan också vara fördelaktigt att komplettera dissektionslösningen med RNAashämmare. När det gäller S2-cellodling och transfektion, utför alla steg i den laminära flödeshuven.
RNA-isoleringssteget kräver ytterligare överväganden. Vi rekommenderar att du använder ett renrum av laminär flödestyp som är förbehandlat med RNase-avlägsnande lösningar. Förutom RNA-utbytet är det viktigt att kontrollera RNA-integriteten för att säkerställa att provet inte har försämrats under dissektions- och isoleringsstegen. RNA-integritet kan visualiseras genom denaturering av agarosgelelektrofores. Det totala RNA:t från Drosophila uppvisar en enda bandningsprofil eftersom 28S rRNA är dissocierat i två lika stora subenheter, som sammanfaller med 18S rRNA25. Detta kan ses som ett enda band på cirka 600 nukleotider när man använder en enkelsträngad RNA-stege (Figur 2A).
Isolerade RNA-prover utsätts för G/I-svansning (figur 2B). Guanosin- och inosinrester tillsätts i 3′-änden av RNA av jästpoly(A)polymeras (PAP)17, vilket bevarar 3′-änden av RNA från enzymatisk nedbrytning. De nyligen syntetiserade G/I-taggskyddade fullängds-RNA:erna transkriberas omvänt för att ge cDNA-prover med hjälp av den universella omvända primern (3'-märkt C10T2). Följt av en PCR med de genspecifika framåt/bakåt-primrarna direkt uppströms polyadenyleringsstället för att generera en PCR-produkt som visar ett skarpt band. PCR-reaktionerna från en genspecifik framåt- och universalreverseprimer genererar odefinierade längder av DNA-molekyler som ett utstryk på gelen, vilket återspeglar varierande längder på poly(A)-svansar. PCR-produkterna analyserades därefter med kapillär gelelektrofores.
Vid design av primers är det viktigt att notera att amplikonstorleken med genspecifika framåt/bakåt-primers bör ligga i intervallet 50-300 bp. Att testa flera framåtriktade primers ger en möjlighet att hitta den bästa primern som fungerar för poly(A) tail assessment. Vi rekommenderar att man utformar en omvänd primer för genspecifika produkter strax uppströms om den förutspådda poly(A)-startplatsen eftersom detta ger en möjlighet till enkel beräkning av poly(A)-svanslängderna. Vid PCR-reaktioner är det viktigt att utföra en "no reverse transcriptase control" för att utesluta amplifiering från kontaminerat genomiskt DNA. PCR-optimering med en glödgningstemperaturgradient rekommenderas starkt. Med tanke på denna metods karaktär kräver analys av poly(A)-svanslängder av alternativt polyadenylerade mRNA-arter ytterligare överväganden. Till exempel genomgår många gener alternativ polyadenylering för att generera olika 3'UTR-arter26. Vi rekommenderar att du använder olika PCR-primeruppsättningar för att studera enskilda 3'UTR-arter.
Vi rekommenderar starkt att du inkluderar den genspecifika PCR-produkten på kapillärgelelektrofores i varje körning eftersom det finns en potentiell migrationsskillnad på några nukleotider i varje körning. Det är viktigt att den faktiska basparstorleken för den genspecifika PCR:n används snarare än de teoretiska storlekarna vid beräkning av poly(A)-svanslängden.
Vissa RNA genomgår ytterligare posttranskriptionella modifieringar, inklusive terminal uridylering27. G/I-tailing-metoden kanske inte är lämplig för att mäta poly(A)-svanslängd när mRNA:t är uridylerat. Detta beror på att den universella omvända primern kanske inte effektivt förstärker mRNA-arten som har icke-adeninnukleotider i sin 3'-ände. G/I-svansning är en PCR-baserad metod som potentiellt skapar oönskad bias genom att förstärka kortare fragment mer effektivt. Därför bör användare vara försiktiga när de tolkar resultatet.
Med hjälp av den metod som presenteras här visade vi att G/I-svansen effektivt kan användas för att mäta poly(A)- svanslängden från nervsystemet Drosophila och S2-celler. Metoden är mycket kvantitativ i kombination med kapillärelektrofores. Även om analyser med hög genomströmning ger global poly(A)-svansanalys, är den PCR-baserade metoden G/I-svansning med låg genomströmning fortfarande mycket användbar för analys av enstaka transkript, pilotexperiment och validering av andra metoder. Sammanfattningsvis beror valet av metod på de specifika forskningsfrågorna och målen. Forskare bör välja den metod som bäst passar deras experimentella behov och resurser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av National Institute of Neurological Disorders och Stroke Grant R01NS116463 till J.K. och Cellular and Molecular Imaging Core-anläggningen vid University of Nevada, Reno, som stöddes av National Institutes of Health Grant P20GM103650 och användes för forskning som rapporterats i denna studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Research Product Internation (RPI) | M92020 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Agilent software 2100 expert free download demo | Agilent Technologies | https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259 | |
| Apex 100 bp-Low DNA Ladder | Genesee Scientific | 19-109 | |
| Bioanalyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C | ||
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Research Product Internation (RPI) | D43060 | |
| DNA dye (Gel Loading Dye, Purple (6x) | New England biolabs | B7024S | |
| Drosophila S2 cell line | Drosophila Genomics Resource Center stock #181 | ||
| Drosophila Schneider’s Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| Ehidium bromide | Genesee scientific | 20-276 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Forceps Dumont 5 | Fine Science tools | 11254-20 | |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| PBS 10x | Research Product Internation (RPI) | P32200 | |
| Poly(A) Tail-Length Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 764551KT | |
| RiboRuler Low Range RNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | SM1833 | |
| RNA Gel Loading Dye (2x) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | |
| RNA microprep kit | Zymoresearch | R1050 | |
| RNA miniprep kit | Zymoresearch | R1055 | |
| Scissors-Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science tools | 15000-08 | |
| TopVision Agarose Tablets | Thermo Fisher Scientific | R2802 | |
| Tris-Acetate-EDTA (TAE) | Thermo Fisher Scientific | B49 |
References
- Stewart, M. Polyadenylation and nuclear export of mRNAs. Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 2977-2987 (2019).
- Machida, K., et al. Dynamic interaction of poly(A)-binding protein with the ribosome. Scientific Reports. 8 (1), 17435 (2018).
- Eisen, T. J., et al. The dynamics of cytoplasmic mRNA metabolism. Molecular Cell. 77 (4), 786-799 (2020).
- Liudkovska, V., Dziembowski, A. Functions and mechanisms of RNA tailing by metazoan terminal nucleotidyltransferases. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 12 (2), e1622 (2021).
- Goldstrohm, A. C., Wickens, M. Multifunctional deadenylase complexes diversify mRNA control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (4), 337-344 (2008).
- Schmidt, M. J., Norbury, C. J. Polyadenylation and beyond: emerging roles for noncanonical poly(A) polymerases. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 1 (1), 142-151 (2010).
- Laishram, R. S. Poly(A) polymerase (PAP) diversity in gene expression - Star-PAP vs canonical PAP. FEBS Letters. 588 (14), 2185-2197 (2014).
- Salles, F. J., Lieberfarb, M. E., Wreden, C., Gergen, J. P., Strickland, S. Coordinate initiation of Drosophila development by regulated polyadenylation of maternal messenger RNAs. Science. 266 (5193), 1996-1999 (1994).
- Wreden, C., Verrotti, A. C., Schisa, J. A., Lieberfarb, M. E., Strickland, S. Nanos and pumilio establish embryonic polarity in Drosophila by promoting posterior deadenylation of hunchback mRNA. Development. 124 (15), 3015-3023 (1997).
- Passmore, L. A., Coller, J. Roles of mRNA poly(A) tails in regulation of eukaryotic gene expression. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (2), 93-106 (2021).
- Murray, E. L., Schoenberg, D. R. Assays for determining poly(a) tail length and the polarity of mRNA decay in mammalian cells. Methods in Enzymology. 448, 483-504 (2008).
- Salles, F. J., Strickland, S. Analysis of poly(a) tail lengths by PCR: The PAT assay. Methods in Molecular Biology. 118, 441-448 (1999).
- Salles, F. J., Darrow, A. L., O'Connell, M. L., Strickland, S. Isolation of novel murine maternal mRNAs regulated by cytoplasmic polyadenylation. Genes and Development. 6 (7), 1202-1212 (1992).
- Salles, F. J., Strickland, S. Rapid and sensitive analysis of mRNA polyadenylation states by PCR. Genome Research. 4 (6), 317-321 (1995).
- Janicke, A., Vancuylenberg, J., Boag, P. R., Traven, A., Beilharz, T. H. ePAT: A simple method to tag adenylated RNA to measure poly(a)-tail length and other 3' RACE applications. RNA. 18 (6), 1289-1295 (2012).
- Minasaki, R., Rudel, D., Eckmann, C. R. Increased sensitivity and accuracy of a single-stranded DNA splint-mediated ligation assay (sPAT) reveals poly(a) tail length dynamics of developmentally regulated mRNAs. RNA Biology. 11 (2), 111-123 (2014).
- Martin, G., Keller, W. Tailing and 3'-end labeling of RNA with yeast poly(A) polymerase and various nucleotides. RNA. 4 (2), 226-230 (1998).
- Kusov, Y. Y., Shatirishvili, G., Dzagurov, G., Verena, G. M. A new G-tailing method for the determination of the poly(a) tail length applied to hepatitis a virus RNA. Nucleic Acids Research. 29 (12), 57 (2001).
- Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
- Subtelny, A. O., Eichhorn, S. W., Chen, G. R., Sive, H., Bartel, D. P. Poly(a)-tail profiling reveals an embryonic switch in translational control. Nature. 508 (1), 66-71 (2014).
- Chang, H., Lim, J., Ha, M., Kim, V. N. TAIL-seq: Genome-wide determination of poly(a) tail length and 3' end modifications. Molecular Cell. 53 (6), 1044-1052 (2014).
- Legnini, I., Alles, J., Karaiskos, N., Ayoub, S., Rajewsky, N. FLAM-seq: Full-length mRNA sequencing reveals principles of poly(A) tail length control. Nature Methods. 16 (9), 879-886 (2019).
- Garalde, D. R., et al. Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores. Nature Methods. 15 (3), 201-206 (2018).
- Singh, M., Ye, B., Kim, J. H. Dual leucine zipper kinase regulates Dscam expression through a noncanonical function of the cytoplasmic poly(A)-binding protein. Journal of Neuroscience. 42 (31), 6007-6019 (2022).
- Macharia, R. W., Ombura, F. L., Aroko, E. O. Insects' RNA profiling reveals absence of "hidden break" in 28S ribosomal RNA molecule of onion thrips, Thrips tabaci. Journal of Nucleic Acids. 2015, 965294 (2015).
- Miura, P., Sanfilippo, P., Shenker, S., Lai, E. C. Alternative polyadenylation in the nervous system: to what lengths will 3' UTR extensions take us. Bioessays. 36 (8), 766-777 (2014).
- Sement, F. M., et al. et al Uridylation prevents 3' trimming of oligoadenylated mRNAs. Nucleic Acids Research. 41 (14), 7115-7127 (2013).
