Мягкий Агар колонии Формирование анализа: метод для проверки воздействия новых соединений на распространение раковых клеток

Overview

Это видео описывает мягкий агар колонии формирования анализа для проверки воздействия ингибитора фермента PADI и BB-Cl-амидин на рак молочной железы опухоли in vitro. Этот анализ также позволяет количественно оценить потенциал трансформации клеток в контексте генетических возмущений.

Protocol

1. Подготовка 3% 2-Гидроксиэтил Агароз

1. В чистую, сухую стеклянную бутылку по 100 мл добавьте 0,9 г 2-гидроксиэтил агарозы (Агароз VII), а затем 30 мл дистиллированной воды.
2. Микроволновая печь смесь в течение 15 сек и осторожно вихрем. Повторите этот шаг по крайней мере еще три раза, пока порошок агарозы полностью не растворится.
3. Автоклав, содержащий раствор бутылки в течение 15 мин.
4. Разрешить агарозный раствор остыть до RT перед дальнейшим использованием. Храните решение на RT.

2. Подготовка нижнего слоя: 0,6% агарозный гель

1. Предварительно разогреть несколько 5 мл и 10 мл пипеток в инкубаторе 37 градусов по Цельсию, чтобы предотвратить затвердевение агарозы в пипетки при обработке.
2. Частично ослабить крышку бутылки и микроволновой печи предварительно сделанные 3% 2-гидроксиэтил агарозный раствор в течение 15 сек. Затем осторожно закружить раствор и микроволновой печи еще 15 сек.
   ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны при закручении агарозного раствора, потому что раствор поднимается при воздействии воздуха и может перекинуться.
3. Если в бутылке есть остаточный твердый гель, микроволновая печь еще несколько секунд.
4. Храните бутылку, содержащую раствор агарозы, в водяной бане с 45 градусами Цельсия во время следующих шагов, чтобы предотвратить преждевременное затвердевение раствора агарозы.
5. Теплый MCF10DCIS средств массовой информации в 37 градусов по Цельсию водяной бане.
   ПРИМЕЧАНИЕ: СРЕДСТВА MCF10DCIS состоят из DMEM/F12, 5% конской сыворотки, 5% пенициллина стрептомицина.
6. Перенесите 3 мл 3% раствора агарозы с помощью предварительно разогретых пипеток в стерильную 50 мл конической трубки.
7. Немедленно добавьте 12 мл теплого СРЕДСТВА MCF10DCIS и аккуратно инвертировать коническую трубку, чтобы смешать агарозу со средствами массовой информации. Старайтесь не образовывать пузырьки, так как это помешает колонии считать позже.
8. Аккуратно добавьте 2 мл этой смеси в каждый колодец 6-хорошо культуры пластины без формирования каких-либо пузырьков воздуха.
9. Инкубировать 6-хорошо культуры пластины горизонтально на плоской поверхности при 4 градусов по Цельсию в течение 1 часа, чтобы смесь затвердеть.
10. После того, как смесь затвердеет, поместите пластину в инкубатор 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут. Нижний слой готов к использованию.

3. Подготовка клеточно-содержащего слоя: 0,3% агарозный гель

1. Трипсинизировать клетки MCF10DCIS и разбавить их до концентрации клеток 4 х 10⁴ /мл.
2. Возьмите 2 мл 3% агарозы с помощью предварительно разогретых пипеток и перенесите в стерильную 50 мл конической трубки.
3. Немедленно добавьте 8 мл средств MCF10DCIS в коническую трубку и аккуратно инвертировать, чтобы смешать агарозу со средствами массовой информации. Избегайте формирования каких-либо пузырьков.
4. Возьмите 2 мл клеток MCF10DCIS (4 x 10⁴ /мл) и обработать с помощью BB-CLA (0 МКМ (DMSO) или 1 МКМ).
5. В разбавлении 1:1 смешайте клетки с 0,6% агарозой.
6. Возьмите 1 мл клеточной агарозной смеси и аккуратно добавьте на нижний слой пластины культуры 6-колодец (2 x 10⁴ клетки/мл).
7. Поместите 6-хорошо культурную пластину горизонтально на плоскую поверхность при 4 градусов по Цельсию, по крайней мере 15 минут, чтобы верхний слой затвердеть.
8. После того, как смесь затвердеет, поместите пластину в инкубатор 37 градусов по Цельсию в течение недели, прежде чем добавить слой кормления.

4. Подготовка кормового слоя: 0,3% Агароза Гель

1. Микроволновая печь предварительно сделанные 3% 2-Гидроксиэтил агарозный раствор в течение 15 сек. осторожно закружить раствор и микроволновой печи еще 15 сек.
2. Equilibrate бутылку раствора агарозы в водяной бане 45 градусов по Цельсию.
3. Разогреть средства MCF10DCIS в водяной бане с 37 градусами Цельсия.
4. Смешайте 1 мл 3% раствора агарозы с 9 мл теплого СРЕДСТВА MCF10DCIS в 50 мл конической трубки и аккуратно инвертировать, чтобы смешать агарозу со средствами массовой информации. Избегайте формирования пузырьков воздуха.
5. Лечить смесь с BB-CLA (0 ЗМ (DMSO) или 1 МКМ).
6. Аккуратно добавьте 1 мл этой смеси (без формирования пузырьков) в каждый колодец из 6-колодец культуры пластины, содержащей нижние и мягкие слои.
7. Поместите 6-хорошо культурную пластину горизонтально на плоскую поверхность при 4 градусов по Цельсию, по крайней мере 15 минут, чтобы позволить смеси затвердеть.
8. После того, как слой фидер затвердеет, поместите пластину в инкубатор 37 градусов по Цельсию.
9. Повторяйте эту процедуру кормления еженедельно, накладав 1 мл 0,3% агарозы/среднего/лечения раствора на существующий слой подачи для пополнения клеток новыми носителями до тех пор, пока не будет наблюдаться образование колонии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Агар в мягких и кормушки слоев очень мягкий и, следовательно, добавленные питательные вещества из фидерного слоя будет легко диффузных в клеточно-содержащий слой для достижения клеток.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zeiss Axiopot	Carl Zeiss Microscopy	1021859251
Inverted Microscope	Olympus	CKX41
DMEM/F-12	Lonza BioWhittaker	12-719F
HyClone Donor Equine Serum	Fisher Scientific	SH30074.03
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140-122
2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	39346-81-1