Мягкий Агар колонии Формирование анализа: метод для проверки воздействия новых соединений на распространение раковых клеток

Для начала возьмите соответствующую концентрацию расплавленной агарозы в конической трубке и добавьте к ней нужное количество теплой культуры среды. Аккуратно инвертировать, чтобы смешать содержимое. Добавить эту смесь в каждый колодец из шести хорошо пластины, и дайте ему затвердеть. Это нижний слой. Далее, лечить раковые клетки с соединением интереса и добавить необходимую концентрацию агарозы.

Теперь, залить эту смесь, содержащую желаемое количество клеток на миллилитр в каждой хорошо. Это клеточный слой. Как только среда затвердевает, инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение недели. Приготовьте слой подачи, смешивая агарозу со средой и дополните эту смесь соединением интереса. Аккуратно добавьте этот слой подачи в каждую хорошо, дайте ему затвердеть, и инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию.

Повторите эту процедуру кормления еженедельно, чтобы пополнить клетки со средой, пока колонии форме. Если соединение интереса является ингибитором опухолевой, он будет подавлять рост клеток в результате чего несколько колоний в колодцах. В следующем протоколе, мы будем выполнять мягкий анализ формирования агар колонии для изучения влияния ингибиторов PADI на туморигенность раковых клеток молочной железы.

Начните эту процедуру с подготовки 3% 2-гидроксиетил агарозы. В чистую, сухую стеклянную бутылку весом 100 миллилитров добавьте 0,9 грамма 2-гидроксиэтиловой агарозы с последующим 30 миллилитров дистиллированной воды. Микроволновая печь смесь в течение 15 секунд и осторожно вихрем. Повторите этот шаг, пока порошок агарозы полностью не растворится. Далее, автоклав раствор, содержащий бутылку в течение 15 минут.

Разрешить агарозный раствор остыть до комнатной температуры перед дальнейшим использованием. Предварительно прогреть несколько пяти миллилитров и 10 миллилитров пипетки в 37 градусов по Цельсию инкубатор, чтобы предотвратить агарозы от затвердеть в пипетки при обработке. Частично ослабить крышку бутылки и микроволновой печи предварительно сделал 3% 2-гидроксиэтил агарозный раствор в течение 15 секунд. Затем осторожно закружить раствор и микроволновой печи в течение еще 15 секунд.

Будьте осторожны при закручении агарозного раствора, потому что раствор поднимается при воздействии воздуха и может перекинуться. Если в бутылке есть остаточный твердый гель, микроволновая печь еще несколько секунд. Держите бутылку, содержащую раствор агарозы в водяной бане 45 градусов по Цельсию во время следующих шагов, чтобы предотвратить раствор агарозы от затвердеть преждевременно.

Затем перенесите 12 миллилитров разогретых средств массовой информации с помощью предварительно разогретых пипеток в стерильную 50 миллилитровую коническую трубку. Немедленно добавьте три миллилитров 3% раствора агарозы и аккуратно инвертировать коническую трубку, чтобы смешать агарозу со средствами массовой информации. Затем аккуратно добавьте два миллилитров этой смеси в каждый колодец из шести хорошо культуры пластины без формирования каких-либо пузырьков воздуха. Инкубировать шесть хорошо культуры пластины горизонтально на плоской поверхности при четырех градусах по Цельсию в течение одного часа, чтобы смесь затвердеть.

После того, как смесь затвердеет, поместите пластину в инкубатор 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут. Нижний слой готов к использованию.

Трудный аспект этой процедуры заключается в том, чтобы убедиться, что все клетки распределены поровну и что расплавленный гель агарозы не затвердевать перед добавлением к каждому хорошо, чтобы убедиться, что клетки смешиваются в средствах массовой информации, прежде чем добавлять жидкий гель агарозы. Кроме того, пипетки предварительно нагреваются заранее, чтобы избежать затвердеть при обработке растворов.

Чтобы подготовить ячейку, содержащую слой, сначала попробуйте MCF10DCIS клетки и разбавить их до концентрации клеток 40000 клеток на миллилитр. Затем возьмите восемь миллилитров мультимедиа с помощью предварительно разогретых пипеток и перенесите в стерильную 50-миллилитровую коническую трубку. Немедленно добавьте два миллилитров 3% агарозы в коническую трубку и аккуратно инвертировать, чтобы смешать агарозу со средствами массовой информации. Избегайте формирования каких-либо пузырьков.

Затем возьмите два миллилитров клеток и обработать их двумя микромоляными BB-хлор-амидином в DMSO, или DMSO только в качестве контроля. После лечения, смешать клетки с 0,6% агарозы в один к одному разбавления, чтобы сделать окончательную концентрацию одного микромолара BB-хлор-амидин. Затем возьмите один миллилитр смеси клеточной агарозы и аккуратно добавьте на нижний слой пластины культуры из шести колодец.

Поместите шести-хорошо культуры пластины горизонтально на плоской поверхности при четырех градусах по Цельсию, по крайней мере 15 минут, чтобы верхний слой затвердеть. После того, как смесь затвердеет, поместите пластину в инкубатор 37 градусов по Цельсию в течение недели, прежде чем добавить слой кормления. Начните подготовку слоя кормления путем микроволновой микроволновой 3% 2-гидроксиэтил агарозы решение, как и раньше, и уравновесивания бутылки раствора агарозы в 45 градусов по Цельсию водяной бане.

Смешайте один миллилитр 3% агарозного раствора с девятью миллилитров теплых средств массовой информации в 50 миллилитров конической трубки, и осторожно инвертировать, чтобы смешать агарозу со средствами массовой информации. Избегайте формирования пузырьков воздуха. После лечения смеси с BB-хлор-амидин, аккуратно добавить один миллилитр смеси в каждый колодец из шести хорошо культуры пластины, содержащей нижние и мягкие слои. Затем поместите шести-хорошо культуры пластины горизонтально на плоской поверхности при четырех градусах по Цельсию, по крайней мере 15 минут, чтобы смесь затвердеть.

После того, как слой фидер затвердеет, поместите пластину в инкубатор 37 градусов по Цельсию. Повторите эту процедуру кормления еженедельно, накладав один миллилитр 0,3% агарозы среднего раствора лечения на существующий слой подачи для пополнения клеток с новыми средствами до образования колонии наблюдается.