Summary
这个协议，讨论了现场清扫
Abstract
阐明轴突运输的机制已证明是在决定如何在长途运输中的缺陷会影响不同的神经系统疾病非常重要。在这一重要过程中的缺陷，可以对神经元的运作和发展产生不利影响。我们已经制定了夹层的协议，旨在揭露
Protocol
1。试剂的制备
- 准备加入下列化合物夹层缓冲液配制：氯化钠128毫米，为1mM EGTA，4毫米氯化镁2，氯化钾2MM，5MM的HEPES，并在1000毫升，PH值的36毫米蔗糖7.2和过滤消毒。
2。解剖的准备工作
- Siligard多维数据集：凝胶是削减到约一英寸宽，1英寸长，约1cm高。凝胶立方体被放置在夹层玻璃上滑动。多维数据集可能会使用一次以上。
- 销：解剖的引脚需要额外的短。最好minutien引脚尖锐的底部夹层中。
- 需要一个尖锐的显微解剖春天剪刀。
- 需要两个细尖镊子。
3。收集的幼虫
- 天涯第三龄幼虫表达的GFP标记的囊泡蛋白被收集到一个培养皿。
- 幼虫在去离子水冲洗，摆脱所有的食物。
4。现场清扫的幼虫
- 幼虫被转移到载玻片上的夹层凝胶立方体。幼虫沉浸在清扫缓冲区。
- 幼虫是不眠不休的前部和后部背侧使用两个罚款引脚最多。
- 利用显微切割剪刀，一小截在中线附近后结束。从这个切口降息前。使用两个引脚，引脚外侧边缘切割角质层。
- 添加一个缓冲区解剖下降。用镊子小心取出肠道，肠和脂肪体。大多数这些组织通常在背切割渗出。
- 更换新鲜解剖缓冲区的缓冲区。幼虫不应该干的，应该不断在解剖缓冲区。
- 在这个时候， 在体内标记MitoTracker或LysoTracker使用的孵化完成稀释体内夹层缓冲标记。解剖幼虫体内标记后的潜伏期洗几次（5快速清洗）使用新鲜解剖缓冲区。
- 更换后的最后一次洗涤推入syligard立即盖玻片的针脚。现在准备观察幼虫。
5。实时成像的解剖幼虫
- 放置到显微镜阶段和图像，使用倒置显微镜的盖玻片和凝胶。
- 我们使用了100X的镜头形象标签囊泡内幼虫节段性神经。首先计算前节段性神经成像在腹侧神经节细胞体的绿色荧光蛋白表达。如果强大的绿色荧光染色观察腹侧神经节细胞体，神经成像和用于评估。
- 使用过滤器，对CFP / YFP的或RFP / YFP和拆分视图软件的同时，我们可以形象两个标签的蛋白质在体内的双显示系统。
6。代表性的成果
图1：注意GFP的斑点，较轴索积累内幼虫节段性神经轴突轨道上呈现出许多轴突囊泡的一个形象代表。
图2：一个单一的轴突轨道内幼虫节段性神经轴突囊泡的形象代表。
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Discussion
在在果蝇幼虫节段性神经突触囊泡运输体内成像研究轴突运输的机制是一个功能强大的工具。我们以前使用的协议，以评估表达扩大polyQ重复澄清，如何扩大重复影响囊泡运输的动态3幼虫神经内运输动态。使用此协议的囊泡的运动速度可确定转换的视频流，一个kymograph。使用遗传学，GFP囊泡运输可以在一个单一的轴突或几个轴突内的可视化，通过使用一个特定的GAL4驱动驱动GFP表达。此外，交通的动态，也可以观察载有特定的基因突变的幼虫。此外，两个小泡具有不同的GFP变种（CFP或RFP）的标签，可同时显示。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
SG是从美国纽约州立大学布法罗分校和约翰R. Oishei基金会的资金支持。
MK是支持在UB由CURCA学生研究奖。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 Pair Micro Dissection Scissors | Fine Science Tools | Spring scissors – 6mm blade. 0.125 mm tip diameter | |
| 2 Pair Forceps | Fisher Scientific | Fisherbrand Dissecting Micro-Adson serrated tip forceps | |
| Box of Dissection Pins | Fine Science Tools | Minutien Pins 0.1mm diameter |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144, 1075-1085 (1996).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
