تقييم التوزيع المكاني للγH2AX التالية الإشعاعات المؤينة
Summary
وقد أصبح التحليل المجهري للبؤر γH2AX ، والتي تشكل في أعقاب الفسفرة من H2AX في سر – 139 ردا على فواصل المزدوج حبلا الحمض النووي ، وأداة لا تقدر بثمن في مجال البيولوجيا الإشعاعية. المستخدمة هنا نحن جسم مضاد لأحادية ميثليته H3 هيستون في ليسين (4) وعلامة جينية من كروماتين حقيقي بنشاط الاختزال ، لتقييم التوزيع المكاني للتشكيل γH2AX الإشعاع الناجم داخل النواة.
Abstract
استجابة مبكرة الجزيئية في الحمض النووي مزدوج الجديلة (DSBs) هو من بقايا الفسفرة 139 سر داخل المحطة عزر SQEY من 1،2 H2AX هيستون. وتتوسط هذه الفسفرة من H2AX من فسفاتيديل inosito – 3 – كيناز (PI3K) عائلة من البروتينات ، ورنح توسع الشعيرات تحور (ATM) ، الوحيدات كيناز الحمض النووي من البروتين المحفز وأجهزة الصراف الآلي وRAD3 ذات الصلة 3 (ATR). شكل فسفرته من H2AX ، ويشار إلى γH2AX ، ينتشر في المناطق المتاخمة لونين من موقع جهاز تسوية المنازعات ، وتشكيل بؤر منفصلة ، والتي يمكن رؤيتها بسهولة بواسطة المجهر immunofluorecence 3. وقد تم تحليل والكميات المستخدمة من بؤر γH2AX على نطاق واسع لتقييم DSB تشكيل وإصلاح ، ولا سيما في الاستجابة للأشعة المؤينة وتقييم مدى فعالية مختلف الإشعاع تعديل المركبات والمركبات السامة للخلايا 4.
نظرا لخصوصية وحساسية رائعة هذه العلامة دي نوفو من DSBs ، فقد قدمت أفكارا جديدة في عمليات إصلاح الحمض النووي من التلف وفي سياق لونين. على سبيل المثال ، في مجال البيولوجيا الإشعاعية النموذج المركزي هي أن الحمض النووي هو الهدف الحاسم فيما يتعلق حساسية للإشعاع. في الواقع ، فقد تم التوافق العام في الآراء في هذا المجال إلى حد كبير نظرا لونين كقالب متجانسة للإصلاح الحمض النووي من التلف و. ومع ذلك ، مع استخدام علامة γH2AX كما الجزيئي للDSBs ، وجود تفاوت في γ – تشعيع صنع تشكيل بؤر γH2AX في كروماتين حقيقي ومغاير وقد لوحظ 5-7. في الآونة الأخيرة ، كنا فريقا من الأضداد إما أحادي ، ثنائي أو ثلاثي ميثليته H3 هيستون في ليسين 9 (H3K9me1 ، H3K9me2 ، H3K9me3) والتي هي بصمات جينية من المغاير التأسيسية وإسكات الترانسكربتي ويسين 4 (H3K4me1 ، H3K4me2 ، H3K4me3 ) ، والتي ترتبط بإحكام الاختزال بنشاط مناطق الكروماتين الحقيقي ، والتحقيق في التوزيع المكاني للγH2AX التالية الإشعاعات المؤينة 8. وفقا للأفكار السائدة بخصوص لونين البيولوجيا وأشارت النتائج التي توصلنا اليها وجود ارتباط وثيق بين تشكيل γH2AX والنسخ النشطة 9. نحن هنا لدينا وسيلة إثبات المناعي للكشف عن الكميات وبؤر γH2AX غير ملتصقة في الخلايا ، مع التركيز بوجه خاص على الترجمة بالتعاون مع علامات جينية أخرى ، تحليل الصور و 3D النمذجة.
Protocol
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ومن المسلم به بدعم من المعهد الأسترالي للعلوم والهندسة النووية. وكان TCK المستلم من الجوائز AINSE. يتم اعتماد مختبر الطب التي Epigenomic الوطني للصحة ومجلس البحوث الطبية في استراليا (566559). ويتم تمويل هذا العمل من قبل لجنة حقوق الطفل للتنمية الطبية المحدودة التصوير ، وأنشأت مراكز الدعم في إطار الحكومة الاسترالية ليالي البحوث التعاونية (CRC) البرنامج. ويدعم LM عن طريق البحث في ملبورن (جامعة ملبورن) والمنح الطبية التكميلية لجنة حقوق الطفل التصوير. وبدعم من جامعة موناش مايكرو التصوير (الدكاترة ستيفن كودي وكارمايكل Iśka) لا تقدر بثمن لهذا العمل.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640) | Growth medium | Invitrogen | 22400071 | RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-Ethanesulfonic Acid |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T6146 | Used to distinguish between live and dead cells. | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | Paraformaldehyde (4%) used to fix cells. |
| Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody | Primary Antibody | Millipore, USA | 16193 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| HistoneH3 (Mono-methyl K4) | Primary Antibody | Abcam, Cambridge, UK | AB8895 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen, USA | 11029 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen, USA | 11035 | |
| TOPRO3 | DNA Stain | Invitrogen, USA | T3605 | TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser. |
| ProLong Gold | Anti-fade solution | Invitrogen | P36930 | This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. |
| Polylysine slides | Menzel-Gläser, Germany | |||
| Coverslips (22x50mm) | Coverslips | Menzel-Gläser, Germany | CS2250100 | |
| Tissue Culture Flask, Vented Cap | Culture Flask | BD Falcon | 353112 | |
| Shandon Cytospin 4 | ThermoElectron Corp | |||
| Cytofunnels | Shandon, Inc. | |||
| Filter Cards | Shandon, Inc | 353025 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| PAP Pen | Zymed Laboratories, Invitrogen | 008877 | ||
| Gammacell 1000 Elite Irradiator | Gamma Irradiator | Nordion International Inc. | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm. | ||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Bonner, W. M. . Nat Rev Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals. J Cell Biol. 178 (2), 209-218 (2007).
- Cowell, I. G. gammaH2AX foci form preferentially in euchromatin after ionising-radiation. PLoS One. 2 (10), e1057-e1057 (2007).
- Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., &, I. l. i. a. k. i. s., G, . Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).
- Vasireddy, R. S., Karagiannis, T. C., El-Osta, A. gamma-radiation-induced gammaH2AX formation occurs preferentially in actively transcribing euchromatic loci. Cell Mol Life Sci. 67 (2), 291-294 (2010).
- Goodarzi, A. A. ATM signaling facilitates repair of DNA double-strand breaks associated with heterochromatin. Mol Cell. 31 (2), 167-177 (2008).
