L'analyse microscopique des γH2AX foyers, qui forment la suite de la phosphorylation de H2AX à Ser-139, en réponse à l'ADN des cassures double brin, est devenu un outil précieux dans la radiobiologie. Ici nous avons utilisé un anticorps mono-méthylé histone H3 lysine à 4 comme un marqueur épigénétique de la transcription euchromatine active, afin d'évaluer la distribution spatiale du rayonnement induit par la formation γH2AX au sein du noyau.
Une réponse précoce moléculaires de l'ADN double-brin (CDB) est la phosphorylation de la Ser-139 résidus dans le motif de SQEY terminale de l'histone H2AX 1,2. Cette phosphorylation de H2AX est médiée par la phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) famille de protéines, de l'ataxie télangiectasie muté (ATM), sous-unité kinase ADN-protéines catalytiques et ATM et RAD3 liés (ATR) 3. La forme phosphorylée de H2AX, dénommé γH2AX, se répand dans les régions adjacentes de la chromatine sur le site de l'ORD, formant des foyers distincts, qui sont facilement visualisés par microscopie à 3 immunofluorecence. Analyse et quantification de γH2AX foyers a été largement utilisé pour évaluer la formation et la réparation ORD, en particulier en réponse aux rayonnements ionisants et pour évaluer l'efficacité de rayonnement différents composés et modifiant composés cytotoxiques 4.
Compte tenu de la spécificité et la sensibilité exquise de ce marqueur de novo de CDB, il a fourni de nouvelles perspectives dans le processus d'endommagement de l'ADN et la réparation dans le contexte de la chromatine. Par exemple, en radiobiologie le paradigme central est que l'ADN nucléaire est la cible critique à l'égard de la sensibilité aux rayonnements. En effet, le consensus général dans le domaine a été largement pour voir la chromatine comme un modèle homogène pour dommages à l'ADN et la réparation. Cependant, avec l'utilisation de γH2AX comme marqueur moléculaire de la CDB, une disparité dans γ-irradiation formation γH2AX foyers dans l'euchromatine et l'hétérochromatine a été observé 5-7. Récemment, nous avons utilisé un panel d'anticorps mono-, di-ou tri-méthylé histone H3 lysine 9 au (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3), qui sont empreintes épigénétiques de l'hétérochromatine constitutive et le silencing transcriptionnel et lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3 ), qui sont étroitement corrélées activement transcrire régions euchromatiques, pour étudier la distribution spatiale des rayonnements ionisants γH2AX suivantes 8. En conformité avec les idées dominantes sur la biologie de la chromatine, nos résultats montrent une corrélation étroite entre la formation et la transcription γH2AX actif 9. Ici nous démontrons notre méthode d'immunofluorescence pour la détection et la quantification des γH2AX foyers dans des cellules non adhérentes, avec un accent particulier sur la co-localisation avec d'autres marqueurs épigénétiques, analyse d'image et de modélisation 3D.
The authors have nothing to disclose.
Le soutien de l'Institut australien des sciences et techniques nucléaires est reconnu. TCK a été récipiendaire du prix AINSE. Laboratoire de médecine épigénomique est soutenu par la National Health and Medical Research Council de l'Australie (566 559). Ce travail est financé par le CRC d'Imagerie Biomédicale Development Ltd, établie et soutenue dans les centres du gouvernement australien s de Recherche Coopérative (CRC). LM est soutenue par la recherche de Melbourne (Université de Melbourne) et biomédicale bourses d'imagerie complémentaires CRC. Le soutien de Monash Micro Imaging (Drs Stephen Cody et Iska Carmichael) a été inestimable pour ce travail.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640) | Growth medium | Invitrogen | 22400071 | RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-Ethanesulfonic Acid |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | ||
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
Trypan blue | Sigma Aldrich | T6146 | Used to distinguish between live and dead cells. | |
Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | Paraformaldehyde (4%) used to fix cells. |
Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody | Primary Antibody | Millipore, USA | 16193 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
HistoneH3 (Mono-methyl K4) | Primary Antibody | Abcam, Cambridge, UK | AB8895 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen, USA | 11029 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen, USA | 11035 | |
TOPRO3 | DNA Stain | Invitrogen, USA | T3605 | TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser. |
ProLong Gold | Anti-fade solution | Invitrogen | P36930 | This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. |
Polylysine slides | Menzel-Gläser, Germany | |||
Coverslips (22x50mm) | Coverslips | Menzel-Gläser, Germany | CS2250100 | |
Tissue Culture Flask, Vented Cap | Culture Flask | BD Falcon | 353112 | |
Shandon Cytospin 4 | ThermoElectron Corp | |||
Cytofunnels | Shandon, Inc. | |||
Filter Cards | Shandon, Inc | 353025 | ||
Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
PAP Pen | Zymed Laboratories, Invitrogen | 008877 | ||
Gammacell 1000 Elite Irradiator | Gamma Irradiator | Nordion International Inc. | ||
Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm. | ||
Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |