Avaliação da Distribuição Espacial da γH2AX seguintes Radiação Ionizante

Summary

Análise microscópica de γH2AX focos, que formam após a fosforilação de H2AX em Ser-139 em resposta ao DNA dupla fita-breaks, tornou-se uma ferramenta valiosa na biologia da radiação. Aqui usamos um anticorpo mono-metilado histona H3 em lisina 4 como um marcador epigenético ativamente de eucromatina transcrever, para avaliar a distribuição espacial da radiação induzida por formação γH2AX dentro do núcleo.

Abstract

Uma resposta rápida molecular de DNA de fita dupla-breaks (LAP) é a fosforilação da Ser-139 resíduos dentro do tema SQEY terminal do ^1,2 H2AX histonas. Esta fosforilação de H2AX é mediada pela fosfatidil-inosito 3-quinase (PI3K) família de proteínas, ataxia telangiectasia mutantes (ATM), subunidade proteína-quinase DNA catalítico e ATM e Rad3 relacionados (ATR) ^3. A forma fosforilada da H2AX, referido como γH2AX, se espalha para regiões adjacentes da cromatina a partir do site do DSB, formando focos discretos, que são facilmente visualizados por microscopia immunofluorecence ^3. Análise e quantificação de γH2AX focos tem sido amplamente utilizada para avaliar DSB formação e reparação, especialmente em resposta à radiação ionizante e para avaliar a eficácia da radiação modificando vários compostos e compostos citotóxicos ^4.

Dada a especificidade e sensibilidade requintada deste marcador de novo de LAP, tem fornecido novos insights sobre os processos de danos no DNA e reparo no contexto da cromatina. Por exemplo, na biologia da radiação, o paradigma central é que o DNA nuclear é o alvo crítico com relação à sensibilidade à radiação. Na verdade, o consenso geral no campo tem sido em grande parte para ver cromatina como um modelo homogêneo para danos no DNA e reparo. No entanto, com o uso de γH2AX como marcador molecular de LAP, uma disparidade de γ-induzida por irradiação formação γH2AX focos em eucromatina e heterocromatina foi observada ^5-7. Recentemente, foi utilizado um painel de anticorpos para mono-, di-ou tri-metilados histona H3 em lisina 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3), que são marcas epigenéticas de heterocromatina constitutiva e silenciamento transcricional e lisina 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3 ), que estão fortemente correlacionados ativamente transcrever regiões eucromáticos, para investigar a distribuição espacial da radiação ionizante γH2AX seguintes ^8. De acordo com as idéias predominantes em relação à biologia da cromatina, nossos resultados indicaram uma estreita correlação entre a formação γH2AX e transcrição ativa ^9. Aqui nós demonstramos o nosso método de imunofluorescência para detecção e quantificação de γH2AX focos em células não aderentes, com um foco particular em co-localização com outros marcadores epigenéticos, análise de imagens e modelagem 3D.

Protocol

Preparação celular Humana erythroleukemic K562 células são cultivadas em RPMI-1640 meio suplementado com 10% (v / v) de soro fetal bovino e 20 mg / ml de gentamicina em um 5% CO 2 umidificado ambiente a 37 ° C. Aproximadamente 18 horas antes da coloração lavar exponencialmente células de crescimento (ideal a 5 x 10 5 células / ml) com tampão fosfato salino (PBS), ressuspender em novas mídias e voltar para 37 ° C, 5% CO 2. Lave as células duas v…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640)	Growth medium	Invitrogen	22400071	RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-Ethanesulfonic Acid
Fetal Bovine Serum (FBS)		Sigma-Aldrich	F2442
Bovine Serum Albumin (BSA)		Sigma-Aldrich	A7906	BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.
PBS (without Ca2+ and Mg2+)		Invitrogen	17-517Q
Trypan blue		Sigma Aldrich	T6146	Used to distinguish between live and dead cells.
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	158127	Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.
Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody	Primary Antibody	Millipore, USA	16193	Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.
HistoneH3 (Mono-methyl K4)	Primary Antibody	Abcam, Cambridge, UK	AB8895
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen, USA	11029	Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen, USA	11035
TOPRO3	DNA Stain	Invitrogen, USA	T3605	TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser.
ProLong Gold	Anti-fade solution	Invitrogen	P36930	This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index.
Polylysine slides		Menzel-Gläser, Germany
Coverslips (22x50mm)	Coverslips	Menzel-Gläser, Germany	CS2250100
Tissue Culture Flask, Vented Cap	Culture Flask	BD Falcon	353112
Shandon Cytospin 4		ThermoElectron Corp
Cytofunnels		Shandon, Inc.
Filter Cards		Shandon, Inc	353025
Coplin Jar, glass		Grale Scientific P/L	1771-OG
Staining Trough		Grale Scientific P/L	V1991.99
PAP Pen		Zymed Laboratories, Invitrogen	008877
Gammacell 1000 Elite Irradiator	Gamma Irradiator	Nordion International Inc.
Zeiss LSM 510 Meta Confocal	Confocal Microscope			Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm.
Metamorph	Software for Imaging analysis	Molecular Devices, USA