電離放射線は、次のγH2AXの空間分布の評価
Summary
DNA二本鎖切断に対する応答のSer – 139のH2AXのリン酸化に続いてフォームγH2AX巣、、の顕微鏡分析は、放射線生物学における非常に貴重なツールとなっています。ここでは、核内の放射線誘発γH2AX形成の空間分布を評価するために、積極的に転写ユークロマチンのエピジェネティックマーカーとしてリジン4でモノメチル化ヒストンH3に対する抗体を使用。
Abstract
DNA二本鎖切断（DSB）の初期の分子応答は、ヒストンH2AXの1,2の端子SQEYモチーフ内のセリン- 139残基のリン酸化である。 H2AXのこのリン酸化は、ホスファチジル- inosito 3 -キナーゼ（PI3K）タンパク質のファミリー、毛細血管拡張性運動失調変異（ATM）、DNA -プロテインキナーゼ触媒サブユニットとATMとRAD3関連（ATR）3によって仲介される。 γH2AXと呼ばれるH2AXのリン酸化形態は、、immunofluorecence顕微鏡3で簡単に可視化する離散的な病巣を形成する、DSBのサイトからクロマチンの隣接地域に広がっています。 γH2AX巣の分析と定量は、広く、特に電離放射線に応答して化合物と細胞毒性化合物4を修正する様々な放射線の有効性を評価するため、DSBの形成と修復を評価するために使用されています。
DSBがこのデノボマーカーの絶妙な特異性と感度を考えると、それはクロマチンの文脈におけるDNA損傷と修復のプロセスに新たな洞察を提供しています。例えば、放射線生物学の中心的なパラダイムは、核DNAは、放射線感受性に関する重要なターゲットであるということです。確かに、フィールドの一般的なコンセンサスは、主としてDNA損傷と修復のための均質なテンプレートとしてクロマチンを表示することであった。しかし、DSBが分子マーカー、ユークロマチンとヘテロクロマチンにおけるγ-照射誘起γH2AX巣の形成における格差としてγH2AXの使用5-7観察されている。最近、我々はモノ、どちらジ – または構成的ヘテロクロマチンと転写サイレンシングとリシン4のエピジェネティックな痕跡であるリジン9時、トリメチル化ヒストンH3（H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3）（H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3に対する抗体のパネルを使用）、しっかりと電離放射線8次のγH2AXの空間分布を調査するために、真正染色質領域を転写積極的に相関している。クロマチン生物学に関する現行の考え方に準拠して、我々の調査結果はγH2AX形成し、活発に転写9の間の密接な相関関係を示した。ここでは、他のエピジェネティックなマーカーと共局在、画像解析と3D -モデリングに特に焦点を当て、非接着細胞のγH2AX病巣の検出および定量のための私達の免疫蛍光法を示しています。
Protocol
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
オーストラリア原子科学技術学会のサポートが認められています。 TCKはAINSE賞を受賞しました。エピ医学研究所は、国立保健オーストラリアの医学研究評議会（566559）でサポートされています。この作品は、オーストラリア政府の共同研究センター（CRC）プログラムの下で設立され、サポートされている医学開発株式会社、のためのCRCによって運営されている。 LMは、メルボルン研究所（メルボルン大学）と医学のCRCの補助金によってサポートされています。モナッシュマイクロイメージング（博士スティーブンコーディとISKAカーマイケル）のサポートは、この仕事のための非常に貴重でした。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640) | Growth medium | Invitrogen | 22400071 | RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-Ethanesulfonic Acid |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T6146 | Used to distinguish between live and dead cells. | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | Paraformaldehyde (4%) used to fix cells. |
| Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody | Primary Antibody | Millipore, USA | 16193 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| HistoneH3 (Mono-methyl K4) | Primary Antibody | Abcam, Cambridge, UK | AB8895 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen, USA | 11029 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen, USA | 11035 | |
| TOPRO3 | DNA Stain | Invitrogen, USA | T3605 | TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser. |
| ProLong Gold | Anti-fade solution | Invitrogen | P36930 | This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. |
| Polylysine slides | Menzel-Gläser, Germany | |||
| Coverslips (22x50mm) | Coverslips | Menzel-Gläser, Germany | CS2250100 | |
| Tissue Culture Flask, Vented Cap | Culture Flask | BD Falcon | 353112 | |
| Shandon Cytospin 4 | ThermoElectron Corp | |||
| Cytofunnels | Shandon, Inc. | |||
| Filter Cards | Shandon, Inc | 353025 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| PAP Pen | Zymed Laboratories, Invitrogen | 008877 | ||
| Gammacell 1000 Elite Irradiator | Gamma Irradiator | Nordion International Inc. | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm. | ||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |
References
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