הערכת התפלגות מרחבית של γH2AX הבאים בקרינה מייננת
Summary
ניתוח מיקרוסקופי של γH2AX מוקדים, אשר הטופס הבא זירחון של H2AX ב Ser-139 בתגובה פעמיים גדיל הדנ"א נשבר, הפך להיות כלי רב ערך בביולוגיה קרינה. כאן השתמשנו נוגדנים מונו מפוגל היסטון H3 ב ליזין 4 כסמן epigenetic של euchromatin פעיל לתעתוק, כדי להעריך את הפריסה המרחבית של היווצרות γH2AX קרינה הנגרמת בתוך הגרעין.
Abstract
תגובה מולקולרית מוקדם הדנ"א הכפול גדיל הפסקות (DSBs) הוא זירחון של שאריות סר 139-מוטיב בתוך הטרמינל SQEY של 1,2 H2AX היסטון. זירחון זה של H2AX מתווכת על ידי phosphatidyl inosito-3-kinase (PI3K) משפחה של חלבונים, אטקסיה telangiectasia מוטציה (ATM), ה-DNA למקטע החלבון קינאז קטליטי ATM ו RAD3 הקשורות (ATR) 3. צורת פוספורילציה של H2AX, המכונה γH2AX, מתפשט לאזורים סמוכים של הכרומטין מהאתר של DSB, ויוצרים מוקדים נפרדים, שהם דמיינו בקלות באמצעות מיקרוסקופ immunofluorecence 3. ניתוח quantitation של γH2AX מוקדים כבר בשימוש נרחב על מנת להעריך היווצרות DSB ותיקון, בעיקר בתגובה לקרינה מייננת ו להערכת היעילות של קרינה שונים שינוי תרכובות תרכובות ציטוטוקסיות 4.
לאור רגישות וספציפיות מעולה של סמן זה דה נובו של DSBs, זה סיפק תובנות חדשות על תהליכים של נזק לדנ"א ותיקון בהקשר של הכרומטין. לדוגמה, ביולוגיה קרינה הפרדיגמה המרכזית היא כי ה-DNA גרעיני היא מטרה קריטית לגבי רגישות לקרינה. ואכן, הסכמה כללית בתחום כבר במידה רבה כדי להציג הכרומטין כתבנית הומוגנית עבור נזק לדנ"א ותיקון. אולם, עם השימוש γH2AX כסמן המולקולרי של DSBs, פער γ-קרינה-Induced היווצרות מוקדים γH2AX ב euchromatin ו heterochromatin נצפתה 5-7. לאחרונה, השתמשנו פאנל של נוגדנים או מונו, די או תלת מפוגל היסטון H3 ב ליזין 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) אשר טביעות epigenetic של heterochromatin המכונן ועל ההשתקה תעתיק וליזין 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3 ), אשר מתואמים היטב פעיל לתעתוק euchromatic האזורים, כדי לחקור את הפריסה המרחבית של γH2AX בעקבות קרינה מייננת 8. בהתאם לרעיונות הרווחת לגבי ביולוגיה הכרומטין, הממצאים שלנו מצביעים על קשר הדוק בין היווצרות γH2AX ו שעתוק פעיל 9. כאן אנו להדגים שיטה immunofluorescence שלנו עבור איתור quantitation של γH2AX מוקדים שאינם חסיד תאים, עם דגש מיוחד על שיתוף לוקליזציה עם סמנים epigenetic אחרים, ניתוח תמונה-3D דוגמנות.
Protocol
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
התמיכה של המכון האוסטרלי גרעיני מדע והנדסה הוא הודה. TCK היה זכה בפרסים AINSE. המעבדה לרפואה epigenomic נתמכת הבריאות הלאומי המועצה למחקר רפואי של אוסטרליה (566,559). עבודה זו ממומנת על ידי ה-CRC עבור ביו הדמיה ופיתוח בע"מ, הוקמה ונתמכת תחת מרכזי שיתופית של ממשלת אוסטרליה מחקר (CRC) בתוכנית. LM נתמך על ידי מלבורן מחקר (אוניברסיטת מלבורן) ו ביו הדמיה מלגות CRC משלים. התמיכה של מונש Micro Imaging (ד"ר סטיבן קודי ואת היתר קרמייקל) היה שלא יסולא בפז עבור עבודה זו.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640) | Growth medium | Invitrogen | 22400071 | RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-Ethanesulfonic Acid |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T6146 | Used to distinguish between live and dead cells. | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | Paraformaldehyde (4%) used to fix cells. |
| Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody | Primary Antibody | Millipore, USA | 16193 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| HistoneH3 (Mono-methyl K4) | Primary Antibody | Abcam, Cambridge, UK | AB8895 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen, USA | 11029 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen, USA | 11035 | |
| TOPRO3 | DNA Stain | Invitrogen, USA | T3605 | TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser. |
| ProLong Gold | Anti-fade solution | Invitrogen | P36930 | This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. |
| Polylysine slides | Menzel-Gläser, Germany | |||
| Coverslips (22x50mm) | Coverslips | Menzel-Gläser, Germany | CS2250100 | |
| Tissue Culture Flask, Vented Cap | Culture Flask | BD Falcon | 353112 | |
| Shandon Cytospin 4 | ThermoElectron Corp | |||
| Cytofunnels | Shandon, Inc. | |||
| Filter Cards | Shandon, Inc | 353025 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| PAP Pen | Zymed Laboratories, Invitrogen | 008877 | ||
| Gammacell 1000 Elite Irradiator | Gamma Irradiator | Nordion International Inc. | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm. | ||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Bonner, W. M. . Nat Rev Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals. J Cell Biol. 178 (2), 209-218 (2007).
- Cowell, I. G. gammaH2AX foci form preferentially in euchromatin after ionising-radiation. PLoS One. 2 (10), e1057-e1057 (2007).
- Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., &, I. l. i. a. k. i. s., G, . Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).
- Vasireddy, R. S., Karagiannis, T. C., El-Osta, A. gamma-radiation-induced gammaH2AX formation occurs preferentially in actively transcribing euchromatic loci. Cell Mol Life Sci. 67 (2), 291-294 (2010).
- Goodarzi, A. A. ATM signaling facilitates repair of DNA double-strand breaks associated with heterochromatin. Mol Cell. 31 (2), 167-177 (2008).
