Mikroskopisk analys av γH2AX härdar, som utgör efter fosforyleringen av H2AX vid Ser-139 som svar på DNA dubbel-strängbrott, har blivit ett ovärderligt verktyg i strålningsbiologi. Här har vi använt en antikropp mot mono-metylerat histon H3 på lysin 4 som en epigenetisk markör för aktivt transkribera euchromatin, för att utvärdera den geografiska fördelningen av strålningsinducerad γH2AX bildning inom kärnan.
En tidig molekylärt svar på DNA dubbel-strängbrott (DSBs) är fosforyleringen av Ser-139 rester i terminalen SQEY motiv av histon H2AX 1,2. Denna fosforylering av H2AX medieras av det fosfatidyl-inosito 3-kinas (PI3K) familj av proteiner, ataxi telangiectasia muterad (ATM), DNA-protein kinas katalytiska subenheten och ATM och RAD3-relaterade (ATR) 3. Den fosforyleras form av H2AX, kallad γH2AX, sprider sig till angränsande regioner i kromatin från platsen för DSB, som utgör diskreta fokus, som är lätt synliga genom immunofluorecence mikroskopi 3. Analys och kvantifiering av γH2AX foci har i stor utsträckning används för att utvärdera DSB bildning och reparation, särskilt som svar på joniserande strålning och för att utvärdera effekten av olika strålning ändra föreningar och cytostatika 4.
Med tanke på den utsökta specificitet och känslighet för denna de novo markör av DSBs har det gett nya insikter i processer av DNA-skador och reparation i samband med kromatin. Till exempel i strålningsbiologi den centrala paradigmet är att kärn-DNA är den kritiska mål med avseende på strålning känslighet. Faktum är att den allmänna uppfattningen i fältet till stor del att se kromatin som en homogen mall för DNA-skador och reparation. Har dock med hjälp av γH2AX som molekylär markör av DSBs, en skillnad i γ-bestrålning-inducerad γH2AX härdar bildas i euchromatin och heterochromatin observerats 5-7. Nyligen använde vi en panel av antikroppar mot antingen mono-, di-eller tri-metylerat histon H3 på lysin 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) som är epigenetiska avtryck av konstitutivt heterochromatin och transkriptionell tysta och lysin 4 H3K4me1 (, H3K4me2, H3K4me3 ), som är tätt korrelerade aktivt transkribera euchromatic regioner, för att undersöka den geografiska fördelningen av γH2AX efter joniserande strålning 8. I enlighet med rådande idéer om kromatin biologi, visade våra resultat ett nära samband mellan γH2AX bildning och aktiv transkription 9. Här kan vi visa vår immunofluorescens metod för detektion och kvantifiering av γH2AX foci i icke-häftande celler, med särskilt fokus på samarbete lokalisering med andra epigenetiska markörer, bildanalys och 3D-modellering.
The authors have nothing to disclose.
Stödet från Australian Institute of Nuclear Science and Engineering är erkänd. TCK var mottagare av AINSE utmärkelser. Epigenomiska Medicin Lab stöds av det nationella hälso-och medicinska forskningsrådet i Australien (566.559). Detta arbete finansieras av CRC för biomedicinsk avbildning Development Ltd, och får stöd enligt den australiensiska regeringens kooperativa Research Centres (CRC) program. LM stöds av Melbourne Research (University of Melbourne) och biomedicinsk avbildning CRC stipendier kompletterande. Stödet från Monash Micro Imaging (DRS Stephen Cody och ISKA Carmichael) var ovärderlig för detta arbete.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640) | Growth medium | Invitrogen | 22400071 | RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-Ethanesulfonic Acid |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | ||
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
Trypan blue | Sigma Aldrich | T6146 | Used to distinguish between live and dead cells. | |
Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | Paraformaldehyde (4%) used to fix cells. |
Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody | Primary Antibody | Millipore, USA | 16193 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
HistoneH3 (Mono-methyl K4) | Primary Antibody | Abcam, Cambridge, UK | AB8895 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen, USA | 11029 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen, USA | 11035 | |
TOPRO3 | DNA Stain | Invitrogen, USA | T3605 | TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser. |
ProLong Gold | Anti-fade solution | Invitrogen | P36930 | This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. |
Polylysine slides | Menzel-Gläser, Germany | |||
Coverslips (22x50mm) | Coverslips | Menzel-Gläser, Germany | CS2250100 | |
Tissue Culture Flask, Vented Cap | Culture Flask | BD Falcon | 353112 | |
Shandon Cytospin 4 | ThermoElectron Corp | |||
Cytofunnels | Shandon, Inc. | |||
Filter Cards | Shandon, Inc | 353025 | ||
Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
PAP Pen | Zymed Laboratories, Invitrogen | 008877 | ||
Gammacell 1000 Elite Irradiator | Gamma Irradiator | Nordion International Inc. | ||
Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm. | ||
Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |