Optimerad Transfektion Strategi för Expression och elektrofysiologiska Inspelningen av rekombinanta spänningskänsliga jonkanaler i HEK-293T celler

Summary

Tillförlitlig metod för mycket effektiv

Abstract

In vitro uttryck och elektrofysiologiska inspelning av rekombinant spänningskänsliga jonkanaler i odlade humana embryonala njur celler (HEK-293T) är en allestädes närvarande forskningsstrategi. HEK-293T cellerna måste vara klädd på glaset täckglas på tillräckligt låg densitet så att de inte har kontakt med varandra för att möjliggöra elektrofysiologiska inspelning utan störande effekter på grund av kontakt med angränsande celler. Transfekterade kanaler måste också uttrycka med hög verkningsgrad vid plasmamembranet för hel-cell patch clamp inspelning av detekterbara strömmar över bullernivåer. Heterologa jonkanaler kräver ofta långa inkubationstider vid 28 ° C efter transfektion för att uppnå tillräcklig membran uttryck, men det finns ökande förluster av cell-täckglas vidhäftning och membranet stabilitet vid denna temperatur. För att kringgå detta problem har vi utvecklat en optimerad strategi att transfektera och plåt HEK-293T celler. Denna metod kräver att celler transfekterade på en relativt hög confluency och inkuberas vid 28 ° C i varierande inkubationstid efter transfektion att möjliggöra adekvat jonkanal protein uttryck. Transfekterade cellerna sedan pläterade på glas täckglas och inkuberas vid 37 ° C under flera timmar, vilket möjliggör för styva cellbindning till täckglas och membran restabilization. Celler kan spelas in strax efter plätering, eller kan överföras till 28 ° C för vidare inkubering. Vi finner att den ursprungliga inkubation vid 28 ° C, efter transfektion men innan plätering, är nyckeln till den effektiva uttryck för heterolog jonkanaler som normalt inte uttrycker bra i plasmamembranet. Positivt transfekterade är odlade celler identifieras av samarbete uttryckta-EGFP eller EGFP uttryck från en bicistronic vektorer (t.ex. pIRES2-EGFP) som innehåller rekombinanta jonkanal cDNA strax uppströms om en intern ribosomen inträde webbplats och en EGFP kodning sekvens. Helcells-patch clamp inspelning kräver specialutrustning, plus hantverk av polerat inspelning elektroder och L-formade elektroder marken från borosilikatglas. Drug delivery att studera farmakologi jonkanaler kan uppnås genom direkt micropipetting narkotika till inspelningen skålen, eller genom att använda microperfusion eller av jordens dragningskraft flödessystem som producerar oavbrutet strömmar av medicinska lösningen över inspelade celler.

Protocol

1. Cell Culture

1. Humana embryonala njur 293T celler (HEK-293T, Invitrogen) odlas anhängare monolager i portad 25 cm ² kolvar (vävnadskultur behandlas, Cellstar, Greiner Bio-One) som innehåller 6 ml av Dulbecco ändrade Eagles Medium (DMEM, Sigma Aldrich) kompletterad med 10 % v / v fetalt bovinserum (FBS, Sigma Aldrich), 1% natrium pyruvat och 250 mikrogram / ​​ml penicillin / streptomycin vid 37 ° C med 5% CO _2).
   
   Cellerna inkuberas i CO ₂ inkubatorer (5% CO ₂₎ anges till 37 ° C eller 28 ° C. Allt arbete med celler sker i ett laminärt flöde huva.
   
   
2. Celler är vanligtvis delas varannan vecka, från ~ 90% confluency, i en 1:08 spädning på måndagar och 01:12 på torsdagar. (Se figur 1 för bilder av HEK-293T celler klädd vid olika tätheter)
3. För klyvning, media bort från flaskor med celler genom aspiration, och cellerna loss genom att använda 1 mL av trypsin (Sigma Aldrich) lösning upphettas till 37 ° C för att den inverterade kolven. Kolven därefter inverterad och försiktigt skakade hand så att trypsin lösning rör sig över bifogade celler flera gånger. Den trypsin är sedan snabbt bort av aspiration och 250 mikroliter av trypsin är micropipetted i kolven, som återigen vaggas att flytta trypsin lösningen över cellerna.
4. Kolvar inkuberas därefter i en CO _2-inkubator inställd på 37 ° C i 3-5 minuter, och en pipett används för att skjuta upp cellerna i 4 ml varm kompletteras DMEM. Ofullständig trypsinization och fjädring kommer att orsaka klumpar av celler och kan orsaka cellerna att växa uppåt och inte i den avsedda monolager. Över-trypsinization kan skada cellerna.
5. För en 01:08 split, lägg 500μL av suspenderade celler läggs till en ny kolv som innehåller 5.5ml av DMEM, för en 1:12 split (se figur 1), 333μL av celler läggs till en ny kolv som innehåller 5.7mL av DMEM . Kolvar är försiktigt blandas överförs sedan till en 37 ° C inkubator. Under 3-4h inkubation vid 37 ° C efter delning, cellerna kommer sediment och följer kolven. Cellerna ser initialt runda men platta och har anknytningar (pseudopodia) med fastare fäste (Figur 1).
   
   Celler ska växa i en anhängare cellslager på ett förutsägbart sätt. Skulle celltillväxt och utseende vara atypisk eller oförenlig dålig teknik eller kontamination (bakterier / Mycoplasma) bör övervägas. Nyckeln till framgångsrik vävnadsodling är konsekvent.
   
   

2. Transfektion av HEK-293T med rekombinant jonkanal cDNAs

1. Här är cDNAs från olika jonkanaler klonade in i pIRES2-EGFP plasmid (BD Biosciences Clontech), som möjliggör identifiering av positivt transfekterade cellerna via förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP) fluorescens. Den EGFP produceras i transfekterade celler från samma avskriften som klonade in cDNA, genom översättning påbörjas vid en intern ribosomen post platsen strax nedströms insatsen cDNA och uppströms EGFP kodande sekvensen (Figur 2). Se figur 3 för bilder av fluorescerande HEK-293T, positivt transfererats med subenheter kalciumblockerare i pIRES2-EGFP konstruktioner.
2. Före transfektion, är en helt konfluenta kolv split 1:04 in i en ny kolv, och cellerna har tillåtelse att ansluta vid 37 ° i en CO _2-inkubator C i 3-4 timmar (se figur 1).
3. Efter att cellerna är anslutna, är en standard kalciumfosfat transfektion strategi (Cold Spring Harbor protokoll) används för att introducera konstruktioner som innehåller jonkanal och tillbehör cDNAs subenheten i HEK celler. Vanligtvis totalt 12μg av DNA i 600 mikroliter av transfektion lösning Ise används per flaska / transfektion.
4. Efter transfektion lösningen pipetteras över cellerna droppvis, är kolven placeras i en 37 ° C inkubator över natten.
5. Efter transfektion, celler omsorgsfullt sköljs tre gånger med varmt media eller fosfatbuffrad saltlösning (4-5 ml) genom att pipettera tvättlösningen till en inverterad kolven, sedan långsamt vrida kolven upprätt och skakar kolven så att tvättlösning rör sig över celler. Om detta inte görs noggrant cellerna kunde detatch och några kommer att vara kvar efter tre tvättar steg. Tvätt upprepas ytterligare två gånger, sedan 6 ml medier läggs till kolven och det är inkuberas vid 37 ° C i 2 timmar, sedan överföras till ett 28 ° C inkubator.
6. Framgångsrik transfektion av pIRES2-EGFP konstruktioner kan bekräftas 1 till 3 dagar efter transfektion med ett epifluorescensmikroskop. Celler som fluorescerar grönt när det utsätts för UV-ljus är positivt-transfekterade och bör uttrycka heterologa jonkanaler och proteiner EGFP.

3. Plätering transfekterade HEK293T celler som förberedelse för elektrofysiologiska inspelning

nt "> Olika jonkanaler uttrycka med olika effektivitet i cellmembranet av HEK celler, och som sådan kräver resten av detta protokoll del optimering att maximera uttrycket kanal yta möjliggör framgångsrika elektrofysiologiska inspelning. Redovisning av heterolog jonkanaler i HEK celler, särskilt de från icke-däggdjur källor, kan innebära vissa utmaningar, inklusive (1) stort protein storlekar som kräver lång tid att översätta och lokalisera till plasmamembranet (2) frånvaro eller olikheter i falsning och inriktning motiv på kanalen proteinet nödvändiga i ett däggdjur cellinje (3) skillnader i frekvenser kodon användning från art till art. Alla dessa faktorer sammantaget kan resultera i ett krav för långa inkubationstiderna vid 28 ° C, som säkerställer ett effektivt protein uttryck och yta lokalisering utan celldelning (vilket skulle späda ut Det heterologa cDNAs och proteiner). Tyvärr, inkubation under längre perioder vid 28 ° C leder till cell lossnar och dålig membran stabilitet gör elektrofysiologiska inspelning svårt. Vi bestämde oss för att ändra konventionella transfektion strategier (över Thomas och Smart 2005) för att minimera inkubation vid 28 ° C före inspelningen och för att maximera ytan uttryck. Vår metod kräver att celler transfekterade, ruvade under en period av 3-7 dagar vid 28 ° C, då cellerna avlägsnas genom trypsinization och replated på täckglas och inkuberas vid 37 ° C som restabilizes membran och möjliggör starka engagemang av celler på täckglas. Celler kan sedan spelas in direkt, eller kan inkuberas i ytterligare perioder vid 28 ° C. Vi hittar nicasiling av celler på täckglas vid detta senare tillfälle i vårt sätt att vara absolut nödvändigt för att producera täckglas med ett stort antal kanaler-uttryckande, separat bifogad celler.

Vi presenterar två alternativa strategier, som vi föredrar att använda för jonkanaler och jon komplex kanal som inte innehåller stora extracellulära domäner som kan vara känsliga för trypsin digestion (t.ex. Cav3 spänningsstyrda kalciumkanaler, SENATORE och Spafford 2010), och en som vi använder för jonkanaler som inte innehåller stora extracellulära områden (t.ex. L-typ spänningsstyrda kalciumkanaler och deras subenheter tillbehör,. SENATORE, et al 2010).

1. 1. Cellerna inkuberas vid 28 ° C i 2-6 dagar för att förhindra celldelning och för att möjliggöra för ackumulering av översatt protein. Detta inkubationstid måste bestämmas empiriskt för varje jonkanaler, eftersom ytan uttryck är beroende av inneboende faktorer som avgör hur kanalerna "gryende mRNA och polypeptid sekvenser interagera med translationell maskiner och Utsöndringsvägarna, respektive.
   2. Före plätering, runda glas täckglas (cirklar Nr 1 - 0,13 till 0.17mm tjocka, storlek: 12 mm, Fisher Scientific Kanada, Ottawa, Ontario) är belagda med _poly-L-lysin (Sigma) enligt tillverkarens anvisningar.
   3. Media avlägsnas genom aspiration från transfekterade celler och 1 ml 37 ° C trypsin lösning (Sigma) är micropipetted i en inverterad kolv (cell uppåt). Kolven är sedan sakta vända upprätt läge så att trypsin att köra över cellerna, och kolven är sedan åter inverterad och trypsin bort av aspiration. 250 mikroliter av varma trypsin läggs sedan direkt över celler och kolven inkuberas vid 37 ° C i 3-5 minuter tills cellerna detatch.
   4. Samtidigt är _{poly-L-lysin-belagda} täckglas placeras i 6mm kultur rätter (3-8 per fat) och 5 ml varmt odlingssubstrat läggs till varje rätt.
   5. Trypsinized celler resuspenderas med 4 ml varmt odlingssubstrat genom att pipettera upp och ned ~ 6 ggr, sedan 250-500μL återsuspenderad celler micropipetted i kultur rätter som innehåller täckglas. Före tillsats av celler, är toppen av mikropipett som används för att trycka ner på täckglas för att säkerställa att de är längst ner i skålen.
   6. Cellerna är sedan inkuberas vid 37 ° C i 3 timmar för att tillåta dem att ansluta sig till täckglas, och då de överförs till 28 ° C. Vid denna punkt, cellerna är redo för elektrofysiologiska inspelning, som är idealiskt sker med separata-anslutna celler (Fig. 3 illustrerar transfekterade celler före och efter plätering på täckglas). Lämnar cellerna för länge vid 37 ° C leder till celldelning.
2. 1. Beredning av celler som uttrycker kanaler / komplex kanal med stora extracellulära domäner utförs på ungefär samma sätt som anges ovan, med undantaget att täckglasen inkuberas vid 28 ° C i ytterligare 2-4 dagar innan elektrofysiologiska inspelning görs. Detta möjliggör en ny ansamling av kanaler / kanal Complexes på cellmembranet efter trypsinization.

4. Elektrofysiologiska inspelning av rekombinant kanaler i HEK-293T celler

Flera omfattande resurser finns tillgängliga som beskriver de allmänna begreppen bakomliggande elektrofysiologiska inspelning (t.ex. Ogden och Stanfield 1987, Molleman 2003).

4,1 Elektrofysiologi rigg

En typisk elektrofysiologi rigg (Figur 4) innehåller en förstärkare (t.ex. Axopatch 200B eller Multiclamp 700B förstärkare, Axon Instruments, Union City, Kalifornien), en PC-dator utrustad med en Digidata 1440A analog-till-digital omvandlare gränssnittet i samband med pClamp10.1 programvara (Molecular Devices, Sunnyvale, Kalifornien), utan motor, dubbla pipett manipulatorer (MPC-385-2, Sutter Instrument Company), ett epifluorescensmikroskop (Axiovert 40 CFL, Zeiss Kanada, Toronto, Ontario) och system perfusion (figur 4 och 5 ). Vibrationer är begränsade genom att montera utrustningen på en TMC 63-500 serie vibrationsisolering tabellen (Tekniska Manufacturing Corporation, Peabody. MA). Stray elektriska störningar begränsas med hjälp av en 40 "lång typ II Faradays bur (TMC) kring den elektriska utrustningen monteras på vibrationsisolering bordet. Elektroniska styrsystem (t ex dator och bildskärm, förstärkare, analog-till-digital omvandlare, motor manipulatorn och Valvelink perfusion styrsystem) monteras utanför Faradays bur till en fristående metall elektriska rack (Hammond Manufacturing, Guelph Ontario). All elektrisk utrustning är jordad för att en koppar-distributör och ansluten till en medicinsk grad Isolering Tranformer (1800W, Tripp Lite UL60601-1) som ger linje isolering, ett konsekvent marken och överspänningsskydd.

4,2 Patch pipetter

Borosilikatglas kapillärrör med glödlampa (OD 1.5mm, OD 0.86mm, 15cm längd; BF150-86-15; Sutter Instrument Company) är halveras och infogas i en flammande / Brun Mikropipett Puller Modell P-97 (Sutter Instrument Company) . En pipett-avdragare programmet är optimerat för att ständigt skapa pipetter med motstånd mellan 2 till 5MΩ från elektroden till jord (efter brand polering, Fig. 6) Pipetter är individuellt Fire Polished att jämna pipettspetsen ytor som tillåter tätningar mot cellmembran ( Micro Forge MF-830, Narishige, Japan, Figur 6). Mikropipetter monteras på headstage med en specialiserad hållare (1-HL-U, Molecular Devices, Sunnyvale i Kalifornien).

4,3 Ground elektroder

Den borosilikatglas rör som används för att göra patch pipetter används också för att hänvisa elektroder. Den 15 cm långa rör skärs i 3 bitar. Med 2 spetsig pincett, är rören hålls i en Bunsenbrännare låga tills glaset blir formbar och slangen kan böjas till ett "L" eller "hockeyklubba" formen med en 90o vinkel. Medan glasrör är fortfarande varma, är ett slut omedelbart ned i ett hett 3M CsCl och 1,5% agaroslösningen som dras in i röret med kapillärkraft. När en referenselektrod är helt fylld med lösningen är det placeras i en bägare med kallt vatten. Efter alla av hänvisningen elektroderna är fyllda, de är individuellt torkas med Kimwipes ta bort extra agaros utifrån och är nedsänkt i en 3M CsCl lösning. För elektrofysiologiska inspelning är referenselektroder hölls i en mikroelektrod Holder Half-Cells (hållare 90 F Pellets 1,5 mm, # MEH3RF15, World precisionsinstrument Inc. Sarasota Florida) fylld med 3M CsCl lösning. (Se figur 7 för illustration av en jordelektroden i bad-lösning)

4,4 Elektrofysiologi inspelning lösningar

Olika typer av spänningskänsliga jonkanaler kräver olika inspelning lösningar beroende på jon permeabilitet / selektivitet. För spänningsstyrda kalciumkanaler, celler normalt badar i externa lösningar som innehåller antingen barium eller kalcium vid olika koncentrationer. Till exempel kan elektrofysiologiska inspelning av ryggradslösa Cav3 spänningsstyrda kalciumantagonister (LCav3) utföras med hjälp av en extern lösning innehållande 5mm CaCl _2, 166mm tetraethylammonium (TEA-Cl), 10mm HEPES med ett pH justeras till 7,4 med TEA-OH. Patch pipetter är fyllda med en intern lösning av 125mm CsCl, 10mm EGTA, 2mm CaCl _2, 1mm MgCl _2, 4mm MgATP, 0.3mm Tris-GTP, och 10 mm HEPES med ett pH på 7,2 (SENATORE och Spafford, 2010). Den ryggradslösa L-typ spänningsstyrda kalciumantagonister (LCav1) kan spelas in med hjälp av en extern lösning som innehåller barium som avgiften bärare (15mm BaCl2, 1mm MgCl _2, 10mm HEPES, 40mm TEA-Cl, 72.5mM CsCl, 10mm glukos, med pH-värdet justeras till 7,2 med TEA-OH) och en intern lösning som innehåller 108mm Cs-methanesulfonate, 4mm MgCl _2, 9 mm EGTA, 9mm HEPES, pH justeras till 7,2 med CsOH (SENATORE et al., 2010).

4,5 Hela Cell-inspelning

1. Ett täckglas innehåller transfekterade celler (som uttrycker heterologa jonkanaler eller jon komplex kanal) överförs till en 35mm plast petriskål innehåller ~ 3 ml av externa inspelning lösning. Volymen inspelning lösning måste mätas noggrant när du utför drog experiment där kända mängder av läkemedel ska läggas till skålen med en mikropipett. Elektrofysiologiska inspelningar är oftast utföras vid rumstemperatur, men forskaren kan vilja ändra denna temperatur beroende på experimentet.
2. Celler visualiseras via en epifluorescensmikroskop och en isolerad, positivt-transfekterade, anhängare gröna cellen är centrerad i mitten av synfältet.
3. Plåstret pipetten sänks ner i badet lösningen med en mikromanipulator, som kompletterar kretsen mellan elektroden i plåstret pipetten och referenselektrod. Även i badet läget gör att pClamp10.1 programvaran förstärkaren för att skapa små upprepa spänningen steg mellan pipetten och som referens, och visar det resulterande aktuell som en fyrkantvåg spår (Figur 8A). Detta fyrkantsvåg spår måste nollställas med hjälp av pipetten offset på förstärkaren innan patcha en cell. Pipetten Motståndet mäts genom den pClamp10.1 programvara, och bör vara inom 2-5MΩ.
4. Även i badet läge är pipetten förs in närhet av cellen, vilket kan visualiseras som snabba svängningar i fyrkantvåg spår, då en liten mängd sug appliceras plåstret pipetten för att bilda en gigaohm tätning mellan pipett och membranet (orsakar en komplett platt-line av fyrkantvåg spår, Figur 8B).
5. Programmet ställs sedan om till patch-läge och pipett kapacitans (synliga som små blippar av nuvarande på inledande och avslutande kanter plana nuvarande spår, Figur 8B) kompenseras med pipetten kapacitans ersättning på förstärkaren.
6. En liten men skarp mängd sug appliceras att brista membranet i plåstret och möjliggöra åtkomst av elektroden till insidan av cellen. Framgångsrik membran bristning indikeras genom uppkomsten av stora kapacitiv transienter också på inledande och avslutande kanter nuvarande vågen spår (Figur 8C). När genombrott har uppnåtts, är programmet kopplas till cell-läge och helcells kapacitet ersättning justeras på förstärkaren för att ta bort den kapacitiva transienter. Det finns en fördröjning på ett par minuter för att möjliggöra jämvikt av intracellulära inspelningen lösningen i cellen före inspelningen.
7. Spänning kommandon genereras och data förvärvas med hjälp av en dator utrustad med en Digidata 1440A analog-till-digital omvandlare gränssnittet i samband med pClamp10.1 programvara. Unik spänningen klämma protokoll är skrivna för varje experiment, och dessa används för att registrera jonkanal strömmar från transfekterade cellerna. Figur 9 illustrerar kalcium strömmar in från en HEK-293T cell som manifesterar den ryggradslösa LCav3 spänningsstyrda kalciumantagonister. Cellen hölls vid en spänning på-110mV, och inkrementell depolarisations mellan-70mV och 20 mV togs för att framkalla inåt kalcium strömmar.
8. Inspelade strömmar filtreras vid 10 kHz med hjälp av en låg-pass Bessel-filtret och digitaliserat vid en samplingsfrekvens på 2 kHz. Endast inspelningar med minimal läcka (<10%) används för analys, och inte läcka subtraktion utförs med Clampfit 10,1 programvara.

4,6 Drug studier av inspelade celler

Läkemedel kan vara direkt pipetteras i skålen spelas in. Koncentration av läkemedel kan beräknas om volymen av läkemedel läggas och volym bad lösningen är kända. Dyra eller begränsade mängder av läkemedel kan också läggas till genom microperfusion från en multi-fat grenröret polyimid perfusion penna med ett 250 micron avtagbar spets, antingen en åtta-kanal Smartsquirt trycket mikro perfusion system (Automatisera vetenskapliga) eller självfall system som drivs genom Teflon ventiler och Valvelink8 ventil styrenheter (Automatisera vetenskapliga, se figur 5 för konfigurationer perfusion system). Flöden från microperfusion systemen har fastställts till 0,1 ml per minut i en bäck ut ur perfusionen penna 400 mikrometer från den inspelade cellen. Avståndet mellan perfusion penna tips från inspelningen elektrodspetsen bör vara konsekvent från lapp till lapp, Figur 10 illustrerar ett förslag på avstånd syns vid 40x förstoring. Adekvat flöden ger mättar genomblödning av det inspelade cellen. Innan ett läkemedel experiment utförs med microperfusion, celler jämvikt med microperfusion kontroll bad lösning i en kontinuerlig ström. Minimal avbrott i ån undviks under försöket genom snabb växling från kontroll bad, läkemedel eller tvättlösning. Sug monterad vid kanten av inspelningen skålen kan användas to ta bort överflöd av lösningar, genom manuell sug med en spruta eller med en Slangpumpar driven enhet (t.ex. Ministar Miniatyr DC peristaltiska pumpar, World precisionsinstrument). Man måste vara försiktig eftersom extremt snabb genomblödning inducerar skjuvkrafter som kan ändra kalcium nuvarande (Peng et al. 2005), kan tvätta bort cellen som spelas in, och utarmar drogen reservoaren för snabbt.

Direkt pipeting i skålen vs system perfusion

	Direkt pipettering	Micro perfusion systemet	Självfall perfusion systemet
Volym läkemedel behövs	Måttlig	Låg	Hög
Teknisk skicklighet	Låg	Medium	Medium
Utrustning kostnad	Låg	Betydande	Betydande
Daglig Dags att ställa in och sanering	Ingen	20 + minuter	20 + minuter
Förorening av utrustning	Ingen	Ja	Ja
Felsökning	Lätt	Komplexa	Komplexa
Garanterat läkemedel i rätt	Ja	Inga	Inga
Förlora cell med drogberoende	Ja	Ja	Ja
Kraftigt minska drog konc. genom tvättning	Svårt	Okomplicerad	Okomplicerad
Lätt att göra en multipel kurva dos respons	Mindre än optimala	Okomplicerad	Okomplicerad
Reproducerbarhet av resultat	OK - beroende på lokalisering av pippeting	Bra	Bra

Discussion

Att kunna spela in helcells-strömmar med hjälp av den beskrivna protokoll och lösningar visar att transfektion var framgångsrik och att den önskade spänningskänsliga jonkanaler eller jon komplex kanal finns med betydande mängder i cellmembranet. Om cellerna positivt transfekterade (dvs fluorescerande grön), men har inte inspelningsbar strömmar, extra tid vid 28 ° C kan krävas för att möjliggöra för kanalen proteinet vara ordentligt förpackade och infogas i cellmembranet. Observera att långvarig inkubation vid 28 ° C gör att cellerna lossnar från täckglas och membran destabilisera och samla skräp från döda celler, vilket gör patch clamp spela mer utmanande. Alla tider som föreslås i detta protokoll har optimerats för våra speciella kanaler. Andra kanaler och deras subenheter kan behöva kortare eller längre inkubationstiderna, och våra protokoll kan justeras ytterligare efter behov. För vissa kanaler dålig transfektion effektivitet (dvs. mindre fluorescerande celler och lägre fluorescensintensiteten per cell) ger bättre resultat än effektivt transfekterade, mycket fluorescerande celler. Om cellerna fluorescerande men inte har inspelningsbar strömmar, felsökning punkter att tänka på är: brist på tillbehör protein (er), felaktig blandning av transfektion reagenser, sub-optimal inspelning lösningar, och mutation / rekombination av kanal eller kanal subenheten cDNA konstruktioner producera felaktigt vikta eller icke-uttrycker kanaler.

Figur 1: Mänskliga embryonala njur 293T celler (HEK-293T) odlas i anhängare monolager vid 37oC i CO2 inkubatorer (5% CO2) i ventilerade 25cm2 kolvar till 90% confluency och dela på 1:12, 1:08 och 1:04 spädningar. Celler är vanligtvis delas varannan vecka, från en ~ 90% confluency. För att säkerställa en liknande ~ 90% confluency vid delning, celler delas i en 1:08 spädning på måndagar och 01:12 på torsdagar. Före transfektion, är en helt konfluenta kolv split 1:04 in i en ny kolv, och cellerna får fästa vid 37oC i en CO2-inkubator i 3-4 timmar.

Figur 2: Strategi för heterologa uttryck av jonkanaler i HEK-293T (vänster) jonkanal cDNAs är klonad i flera kloning platsen för pIRES2-EGFP plasmid.. (Höger) transfektion av dessa konstruktioner i HEK celler resulterar i produktionen av mRNA-molekyler som innehåller jonkanal kodande sekvens (röd) strax uppströms om en intern ribosomen post hotellet (IRES, blå) och EGFP kodande sekvens (grön). Jonkanaler översätts och skytteltrafik till cellmembranet via akutmottagningen och endomembrane systemet, medan EGFP är översatt och behålls i cytoplasman.

Figur 3:. Transfection och uttryck för heterolog cDNAs jonkanaler i HEK-293T celler och plätering av celler på täckglas för elektrofysiologiska inspelning (A) (Top paneler) HEK-293T celler inkuberas vid 28 C, fyra dagar efter transfektion med LCav3 kalciumkanaler hyste i pIRES2-EGFP däggdjur CMV uttryck vektor. (Botten paneler) Ovanstående cellerna trypsinized och pläterade på glas täckglas, isolerad för elektrofysiologiska inspelning. Differential interferenskontrast mikroskopi (DIC).

Figur 4:. En typisk elektrofysiologiska inspelning rigg inställning Elektrofysiologiska inspelning rigg komponenter inkluderar en förstärkare (A), en persondator (PC), Digidata 1440A analog till digital omvandlare gränssnitt (C), utan motor, dubbla manipulatorer pipett (PM) ett epifluorescensmikroskop (M), perfusion system (P), TMC 63-500 serie vibrationsisolering tabellen (VT), 40 höga Typ II Faradays bur (FC) och en fristående 19 metall-, el-rack (R).

Figur 5: Perfusion system (A) En självfall system som drivs med hjälp av teflon ventiler och Valvelink8 controllers.. (B) åtta kanal Smartsquirt trycket mikro perfusion system. Multi-Barrel Manifold tips antingen perfusionen är monterad på en motordriven manipulator.

Figur 6:. Polerad, plåster pipetter visas till 10x (vänster) och 40x (höger) förstoringen Patch pipetter genererades av borsilikatglas kapillärrör med glödlampa och eld polerade för att släta ytorna pipettspetsen. En pipett-avdragare program optimerade för att generera pipetter som gav en läsning av 2-5MΩ i vår elektrofysiologi uppsättning.

2314fig7.jpg "alt =" Bild 7 "/>
. Figur 7: jordelektroden och pipetter lapp i inspelningen skålen Patch pipett (höger) och jordelektrod (vänster, vit pil) i inspelningen lösning.

Figur 8:. PClamp10.1 skärmbilder som illustrerar de olika stegen för att göra en patch (A) Fyrkantsvåg spår iakttas när i bad-läge. (B) A Gigaohm tätning i patch-läge leder till en utplaning av torget våg spår med pipett kapacitans synliga som små blippar av nuvarande på inledande och avslutande kanter plana nuvarande spår. (C) Efter genombrottet och samtidigt i cell-läge, är stora kapacitiva transienter sett.

Figur 9:. Elektrofysiologi resultat (vänster) Inspelningsbara inåt spänningskänsliga kalcium strömmar indikerar framgångsrika transfektion och uttryck heterolog jonkanaler (t.ex. LCav3). (Höger) Untransfected celler har ingen inspelningsbar strömmar. Cellerna utsattes för en IV-protokoll som anger att programvaran håller cellen vid-110mV och sedan steg till-70mV för 250msec sedan tillbaka ner till-110mV hålla potential. Varje gång steg ökar med 10mV så att stegen är till-70mV,-60mV osv tills det sista steget är att 20 mV. Resultaten för en ryggradslösa T-typ (Cav3) spänningsstyrda kalciumantagonister homolog från L. stagnalis kallas LCav3.

Figur 10: Arrangemang av elektroder och microperfusion penna i inspelningen lösning (A) Patch pipetter tillverkade av borosilikatglas (höger) och polyamid flera fat grenrör tips för läkemedelsutveckling perfusion (till vänster).. Jordelektrod (tillbaka) av borosilikatglas fyllda med 3M CsCl och 1,5% agaroslösningen böjd som hockeyklubba hölls i mikroelektrod Holder Half-Cells. (B) 40x se genom ett mikroskop av perfusion blyerts spets och inspelning mikroelektrod.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pIRES2-EGFP plasmid	Clontech Laboratories	6029-1
Circle glass coverslips	Fisher Scientific	12-545-80	Circles No. 1 - 0.13 to 0.17mm thick, Size: 12mm
Amplifier	Axon Instruments	Axopatch 200B or Multiclamp 700B
Data Acquisition System	Axon Instruments	Digidata 1440A
Electrophysiology Software	Axon Instruments	pClamp10.1
Pipette manipulators	Sutter Instrument Co.	MPC-385-2
Epifluorescence inverted microscope	Carl Zeiss, Inc.	Axiovert 40 CFL
Headstage	Axon Instruments	CV-7B
Headstage electrode holder	Axon Instruments	1-HL-U
Micr–lectrode holder for ground electrode	World Precision Instruments, Inc.	MEH3RF 15
Electrophysiology capillary tubes	Sutter Instrument Co.	BF-150-86-15	Borosilicate glass with filament, O.D. 1.5mm, O.D. 0.86mm, 15cm long
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Micropipette fire polisher	Narishige International	Micro Forge MF-830
Micro drug perfusion system	AutoMate Scientific, Inc.	SmartSquirt8 Valvelink8.2
Drug perfusion system	AutoMate Scientific, Inc.	Valvelink8.2 with Teflon valves