Summary
Yüksek verimli için güvenilir bir yöntem
Abstract
In vitro ifade ve elektrofizyolojik kayıt kültürlü insan embriyonik böbrek hücrelerinde rekombinant gerilim-kapılı iyon kanalları (HEK-293T), her yerde bir araştırma stratejisi. Komşu hücreler ile temas nedeniyle karıştırıcı etkisi olmadan elektrofizyolojik kayıt için izin vermek için birbirleri ile temas halinde olmayan HEK-293T, böylece hücreleri yeterince düşük yoğunlukta cam lamelleri üzerine kaplama olmalıdır. Transfekte kanalları da gürültü seviyeleri üzerinde saptanabilir akımları tam hücreli yama kelepçe kayıt için plazma membran yüksek verimlilik ile ifade etmelidir. Heterolog iyon kanalları genellikle 28 ° C transfeksiyon sonra yeterli membran ifade elde etmek için uzun inkübasyon süreleri gerektirir, ancak bu sıcaklıkta hücre lamel yapışma ve membran stabilitesi kayıpları artmaktadır. Bu sorunu aşmak için, biz transfect ve plaka HEK-293T hücreleri için optimize edilmiş bir strateji geliştirdi. Bu yöntem hücrelerin nispeten yüksek confluency 28 transfekte ve inkübe olması gerekir ° C yeterli iyon kanalı protein ekspresyonu için izin değişen kuluçka dönemleri post-transfeksiyon. Transfekte hücreler daha sonra cam lamelleri üzerine kaplama ve 37 ° C lamelleri ve membran restabilization sert hücre eki için izin veren birkaç saat inkübe edilir. Hücreler, kısa bir süre kaplama sonra, ya da daha fazla inkübasyon için 28 ° C transfer edilebilir. Biz ilk inkübasyon 28 ° C, transfeksiyon sonra ancak kaplama önce, plazma zarı normalde iyi ifade edemez heterolog iyon kanalları etkin bir şekilde ifade etmek için anahtarı olduğunu bulabilirsiniz. Pozitif transfekte, kültürlü hücreler sadece upstream iç ribozom giriş yeri ve bir eGFP kodlama dizisi cDNA rekombinant iyon kanalı içeren bir bicistronic vektör (örneğin pIRES2-EGFP) ifade, ortak ifade eGFP veya eGFP ile tanımlanır. Tüm hücre yama kelepçe kayıt özel ekipman gerektirir, artı cilalı kayıt elektrotlar ve L şeklindeki zemin elektrotlar borosilikat cam işçiliği. Iyon kanallarının farmakoloji çalışmasında, ilaç dağıtım, doğrudan kayıt çanak içine ilaçlar micropipetting veya microperfusion kaydedilen hücreleri üzerinde kesintisiz akışı ilaç çözüm üretmeye ağırlık akış sistemleri kullanılarak elde edilebilir.
Protocol
1. Hücre Kültürü
- 10 ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Eagles Medium (Sigma Aldrich DMEM), 6mL içeren İnsan embriyonik böbrek 293T hücreleri (HEK-293T, Invitrogen) Bacalı 25cm 2 şişeler (greiner biyo-one;; Cellstar tedavi doku kültürü) yapışık mono tabakaları büyüdü. % v / v fetal sığır serumu (FBS Sigma Aldrich),% 1 sodyum piruvat ve 250 mg / ml penisilin / streptomisin 37 ° ° C ile% 5 CO 2).
Hücreler ya da 37 ° C veya 28 ° C (% 5 CO 2), CO 2 inkübatörlerde inkübe Laminer akış kaputu hücreleri ile tüm çalışmaları yapılır. - Hücreler genellikle Pazartesi günleri 01:08 seyreltme, ~% 90 confluency, iki haftalık bölünmüş ve Perşembe günleri 01:12. (HEK-293T hücreleri kaplama farklı yoğunluklarda görüntüler için Bkz: Şekil 1)
- Yarma için, medya aspirasyon hücre şişeler kaldırılır ve hücrelerin 1 ml 37 ° C ters balona kadar ısıtılır tripsin (Sigma Aldrich) çözümü uygulayarak ayrılmış. Balon daha sonra elle ters ve hafifçe sarsan tripsin çözümü bağlı hücreleri üzerinde birkaç kez hamle böyle. Tripsin sonra hızlı bir şekilde aspirasyonu ve 250 tripsin mcL, bir kez daha, hücreleri üzerinde tripsin çözüm taşımak için sarstı balona micropipetted kaldırılır.
- Şişeler sonra bir CO 2 inkübatör 37 ° C'de 3-5 dakika inkübe edilir ve bir pipet seti, sıcak takviye DMEM 4ml hücrelerin askıya için kullanılır. Eksik trypsinization ve süspansiyon hücre kümeleri neden olur ve hücreleri amaçlanan tek tabaka değil, yukarı ve büyümeye neden olabilir. Aşırı trypsinization hücreleri zarar verebilir.
- 01:08 bölünmüş, asma hücrelerinin 500μL DMEM, 5.5mL içeren yeni bir balona eklenir ekleyin; 01:12 bölünmüş (bkz. Şekil 1), hücre 333μL DMEM, 5.7mL içeren yeni bir balona eklenir . Şişeler hafifçe daha sonra 37 ° C'lik inkübatöre transfer karıştırılır. 37 3-4 saat inkübasyon sırasında ° C ayrıldıktan sonra hücrelerin tortu ve balona bağlı. Hücreler başlangıçta yuvarlak bakmak ama düzleştirmek ve sıkı eki (Şekil 1) uzantıları (pseudopodia) olacaktır.
Hücreler öngörülebilir bir şekilde yapışık bir tek tabaka büyümek gerekir. Hücre büyümesi ve görünümü atipik veya tutarsız, zayıf tekniği veya kontaminasyon (bakteri / mycoplasma) düşünülmelidir olmalı. Başarılı doku kültürü için önemli tutarlılık.
2. Rekombinant iyon kanal cDNAs HEK-293T Transfeksiyon
- Burada cDNAs içine çeşitli iyon kanalları klonlanmış gelişmiş yeşil flüoresan protein (eGFP) floresan ile olumlu transfekte hücrelerinin tanımlanması için olanak sağlayan, (BD Biosciences Clontech) pIRES2 EGFP plazmid. EGFP sadece ekleme cDNA ve eGFP kodlama işlemi (Şekil 2) upstream downstream bir iç ribozom giriş yerinde başlatılan çeviri yoluyla cDNA klonlanmış insert, aynı transkript transfekte hücreleri üretilir. Şekil 3, kalsiyum kanal alt birimden pIRES2 EGFP yapıları ile olumlu transfekte floresan HEK-293T görüntüler için Bkz.
- Transfeksiyon için, önce tamamen konfluent balonuna yeni bir balona 1:4 bölünmüş, ve hücreler 37 takmak için izin ° C 3-4 saat için bir CO 2 inkübatör (bkz. Şekil 1).
- Hücreleri bağlı sonra, standart bir kalsiyum fosfat transfeksiyon stratejisi (Cold Spring Harbor protokolleri) HEK hücre içine iyon kanalı ve aksesuar altbirim cDNAs içeren yapıları tanıtmak için kullanılır. Tipik olarak, transfeksiyon çözüm ise 600 mcL DNA 12μg toplam balon / transfeksiyon başına kullanılır.
- Transfeksiyon çözüm hücreleri açılan bilge üzerinde pipetlenir sonra, balon, gece boyunca 37 ° C inkübatör içine yerleştirilir.
- Aşağıdaki transfeksiyon, hücreleri dikkatli bir şekilde sıcak ortam veya fosfat ile üç kez yıkanır şişeyi ters bir balona yıkama solüsyonu pipetleme sonra yavaş yavaş dik balon dönüm ve sallanan tamponlu tuz (4-5 ml), böylece yıkama solüsyonu üzerine hamle hücreleri. Bu dikkatlice yapıldığında değilse, hücreler detatch ve birkaç yıkama üç adımdan sonra kalacak. Yıkama, iki kez daha tekrarlanır, daha sonra 6 ml medya balona eklenir ve 37 ° transfer 2 saat sonra 28 C ° C'lik inkübatöre inkübe.
- Başarılı pIRES2 EGFP yapıları transfeksiyon Epifloresans mikroskop kullanarak transfeksiyon 1 ila 3 gün sonra teyit edilebilir. UV ışığa maruz kaldığında yeşil floresan Hücreler olumlu transfekte ve heterolog iyon kanalı ve eGFP proteinler ifade etmelidir.
3. Kaplama elektrofizyolojik kayıt için hazırlık HEK293T hücreleri transfekte
nt "> Farklı iyon kanalları HEK hücreleri hücre zarının farklı verimlilik ile ifade gibi, bu protokolün kalan başarılı elektrofizyolojik kayıt için izin veren kanal yüzey ifadesi en üst düzeye çıkarmak için bazı optimizasyon gerektirir. HEK hücreleri heterolog iyon kanalları İfade özellikle memeli olmayan kaynaklardan (1), uzun süre gerektiren büyük protein boyutları tercüme ve plazma zarı (2) yokluğu ya da bir memeli gerekli kanal proteini üzerindeki motiflerin katlama ve hedefleme ayrılıkları ile lokalize dahil olmak üzere bazı zorluklar ortaya çıkabilir hücre hattı (3) türlere türler kodon kullanım frekanslarda farklılıklar Tüm bu faktörlerin birleşimi 28 uzun kuluçka süreleri için bir gereklilik sonucu ° C, hücre bölünmesi olmadan etkili bir protein ekspresyonu ve yüzey lokalizasyonu sağlayan (dışarı sulandırmak hangi heterolog cDNAs ve proteinler) Ne yazık ki, inkübasyon uzun süre 28 ° C hücre dekolmanı ve elektrofizyolojik kayıt zorlaştırır kötü membran istikrar yol açar. inkübasyon en aza indirmek için geleneksel transfeksiyon stratejilerini değiştirmek için karar (Thomas ve Smart 2005) 28 ° C önceden kayıt ve yüzey ifadesi en üst düzeye çıkarmak için. yöntem hücreler 28 3-7 günlük bir süre inkübe transfekte olması gerektirir ° C, sonra da hücre trypsinization tarafından ayrılmış ve lamelleri üzerine replated ve 37 inkübe ° membranlar restabilizes ve lamelleri üzerine hücreleri güçlü bir eklenti sağlar C Hücreler daha sonra hemen kayıt altına, ya da 28 ek süre inkübe edilebilir ° C Biz bu daha sonraki bir aşamada lamelleri üzerine hücre replating yüksek sayıda kanal ifade ile lamelleri, ayrı ekli hücrelerinin üretimi için mutlaka gerekli olduğu yöntem.Ve bir iki alternatif stratejiler, tripsin sindirim (SENATORE ve Spafford 2010 örneğin Cav3 voltaj bağımlı kalsiyum kanalları) karşı savunmasız olabilir büyük ekstrasellüler etki alanı içermeyen iyon kanalları ve iyon kanalı kompleksleri için kullanmayı tercih mevcut (. SENATORE ve ark 2010 örneğin L-tipi voltaj bağımlı kalsiyum kanalları ve aksesuar altbirimden) büyük ekstrasellüler etki alanları içeren iyon kanalları için kullanın.
- Hücreler 28 ° C hücre bölünmesini önlemek ve tercüme protein birikimine izin vermek için 2-6 gün süreyle inkübe edilir. Bu inkübasyon süresi yüzey ifade kanalları 'doğmakta olan mRNA ve polipeptid dizileri sırasıyla translasyonel makine ve sekretuar yolu ile nasıl etkileşimde dikte içsel faktörlere bağlı olduğundan, her bir iyon kanal için deneysel olarak belirlenmiş olmalıdır.
- Kaplama öncesi, yuvarlak cam lamelleri (0.17mm kalınlığında Çemberleri No 1 - 0.13; Boyut: 12 mm, Fisher Scientific Kanada, Ottawa, Ontario) başına üreticinin talimatlarına Poli-L-lisin (Sigma) ile kaplanmıştır.
- Medya transfekte hücreler aspirasyon kaldırılır, ve 1 ml 37 ° C tripsin solüsyonu (Sigma), ters bir balonun (kadar hücre tarafı) içine micropipetted. Balon yavaşça tripsin hücreleri üzerinde çalışmasına izin vermek için dik pozisyonda ters, ve balon daha sonra tekrar ters çevrilir ve tripsin aspirasyon kaldırılır. 250 mcL sıcak tripsin sonra hücreleri üzerine direkt olarak ilave ve şişesi 37 inkübe ° C hücreleri detatch kadar 3-5 dakika.
- Bu arada, poli-L-lisin kaplı lamelleri 6mm kültür kaplarına yerleştirilir (çanak başına 3-8) ve 5 ml ılık kültür ortamı her çanak eklenir.
- Tripsinize hücreler yukarı ve aşağı pipetleme ~ 6 kez 4ml sıcak kültür ortamı ile yeniden süspanse yeniden süspanse hücrelerinin, daha sonra 250-500μL lamelleri içeren kültür kaplarına micropipetted. Yanı sıra hücre önce, mikropipet ucu lamelleri çanak alt olduğundan emin olmak için aşağı itmek için kullanılır.
- Bu hücreler daha sonra 37 ° C, 3 saat için onları lamelleri uymak izin inkübe edilir ve o zaman 28 ° C'ye aktarılır Bu noktada, hücrelerin elektrofizyolojik kayıt için ideal ayrı bağlı hücreleri (Şekil 3 lamelleri üzerine kaplama öncesi ve sonrası transfekte hücreler göstermektedir) ile yapılır hazırız. 37 hücreleri çok uzun süre bırakmak ° C hücre bölünmesi neden olacaktır.
- Büyük ekstrasellüler alanları ile kanal / kanal kompleksleri ifade hücrelerin hazırlanması olduğunu lamelleri ° C elektrofizyolojik kayıt önce bir ek 2-4 gün süreyle gerçekleştirilen 28. inkübe hariç olmak üzere, yukarıda belirtildiği gibi çok aynı şekilde yapılır. Bu yeniden birikim kanalları / kanal c sağlartrypsinization sonra hücre zarı omplexes.
4. HEK-293T hücrelerinde rekombinant kanalları Elektrofizyolojik kayıt
Elektrofizyolojik kayıt (; Molleman 2003 örneğin Ogden ve Stanfield 1987) altında yatan genel kavramları anlatan birçok kapsamlı kaynaklar mevcuttur.
4.1 Elektrofizyoloji teçhizat
PClamp10.1 ile birlikte bir Digidata 1440A analog-dijital dönüştürücü arabirimi ile donatılmış bir PC bilgisayar, tipik bir elektrofizyoloji teçhizat (Şekil 4), bir amplifikatör (Axon Instruments, Union City, CA örneğin Axopatch 200B ve 700B amplifikatör Multiclamp) yazılım (Moleküler Aygıtlar, Sunnyvale, California), motorlu, çift pipet manipülatörler (MPC-385-2, Sutter Instrument Company), bir Epifloresans mikroskobu (Axiovert 40 CFL, Zeiss Kanada, Toronto, Ontario) ve perfüzyon sistemleri (Şekil 4 ve 5 .) Titreşimler bir TMC 63-500 serisi titreşim izolasyonu tablosu (Teknik Manufacturing Corporation, Peabody MA) ekipman montaj sınırlıdır. Kaçak elektrik gürültü, titreşim izolasyonu masaya monte edilmiş elektrik ekipmanları çevreleyen 40 "tall Tip II Faraday Kafesi (TMC) ile sınırlıdır. Elektronik kontrol sistemleri (örneğin, bilgisayar ve monitör, amplifikatör, analog-dijital dönüştürücü, motorlu manipülatör ve gibi Valvelink perfüzyon kontrol sistemi), bağımsız bir metal elektrik raf (Hammond İmalat, Guelph Ontario) Faraday kafesinin dışına monte tüm elektrikli cihazlar, bakır distribütörü topraklı ve Tıbbi Sınıf İzolasyon Çevirme (1800W, Tripp Lite takılı hat izolasyonu, tutarlı bir zemin ve dalgalanma bastırma sağlar UL60601-1).
4.2 Patch pipetler
Filament (BF150-86-15; OD 1.5mm, OD 0.86mm, 15cm uzunluğunda Sutter Instrument Company) ile borosilikat camdan kılcal tüpler yarıya eklenir Brown Mikropipet Çektirme Model Flaming / P-97 (Sutter Instrument Company) . (Pipetler tek tek hücre zarları karşı sızdırmaz sağlar pipet yüzeyleri pürüzsüz cilalı ateş; pipet-çektirmenin programı dirençler toprağa elektrot ila 2 5MΩ (Şekil 6 yangın parlatma sonra) arasında sürekli pipetler oluşturmak için optimize edilmiştir Mikro Forge MF-830; Narishige, Japonya; Şekil 6). Mikropipetler headstage özel bir tutucu (Moleküler Cihazlar, Sunnyvale California 1-HL-U) ile monte edilir.
4.3 Zemin elektrotlar
Yama pipetler yapmak için kullanılan borosilikat cam tüpler de referans elektrotlar yapmak için kullanılır. 15cm uzun tüpler 3 parçalar halinde kesilir. Cam uysal olur ve bir "L" ya da 90 ° lik bir açı ile "hokey sopası" şekli tüp bükülebilir kadar, 2 ince uçlu forseps ile tüpler bir Bunsen beki alev yapılmaktadır. Cam tüpler hala sıcak iken, bir ucunu hemen sıcak bir 3M CSCL ve kapiler eylem tarafından tüp içine çekilir% 1.5 agaroz çözüm batırılır. Bir referans elektrot tamamen çözümü ile doludur sonra, soğuk suyu bir behere konur. Referans elektrot doldurduktan sonra, dışarıdan ilave agaroz kaldırmak için ayrı ayrı Kimwipes ile silinir ve 3M CSCL çözümü batmış. 3M CSCL çözümü ile dolu, elektrofizyolojik kayıt için referans elektrotlar Mikroelektrod Tutucu Half-Hücreleri (Dünya Precision Instruments Inc, Sarasota Florida; # MEH3RF15 Tutucu 90 F Pelet 1.5mm) yapılmaktadır. (Banyo çözümü bir zemin elektrot resme için Bkz: Şekil 7)
4.4 Elektrofizyoloji kayıt çözümleri
Farklı tip gerilim-kapılı iyon kanalları, iyon geçirgenliğini / seçicilik bağlı olarak farklı kayıt çözümleri gerektirir. Voltaj bağımlı kalsiyum kanalları için, hücreler tipik olarak çeşitli konsantrasyonlarda baryum veya kalsiyum içeren harici çözümler ile yıkanan. Örneğin, omurgasız Cav3 voltaj bağımlı kalsiyum kanal (LCav3) elektrofizyolojik kayıt ÇAY-OH ile pH 7.4 'e ayarlanır 5mM CaCl 2, 166mM tetraethylammonium (ÇAY-Cl), 10mM Hepes içeren harici bir çözüm kullanılarak yapılabilir. Patch pipetler 125mm CSCL, 10mM EGTA, 2mm CaCl 2, 1mm MgCl 2, 4mm MgATP, 0.3mm Tris-GTP, ve pH 7.2 (SENATORE ve Spafford, 2010) ile 10mM Hepes bir iç çözeltisi ile doldurulur. Omurgasız L-tipi voltaj bağımlı kalsiyum kanal (LCav1) yük taşıyıcı (15mm BaCl2, 1mm MgCl 2, 10mM Hepes, 40mm ÇAY-Cl, 72.5mm CSCL, 10mM Glikoz, baryum içeren harici bir çözüm kullanılarak kaydedilebilir ÇAY-OH ile pH 7.2 'ye ayarlanır) ve 108mm Cs-methanesulfonate, 4mm MgCl 2, 9mm EGTA, 9mm Hepes CsOH (SENATORE ark ile 7.2 pH değeri ayarlanmış içeren bir iç çözüm, 2010).
4.5 Tüm Hücre Kaydı
- Transfekte hücreler (heterolog iyon kanalları ya da iyon kanal kompleksleri ifade) içeren bir lamel ~ 3ml harici kayıt çözümü içeren bir 35mm plastik petri aktarılır. Kayıt çözümü hacmi bilinen miktarlarda ilaç mikropipet çanak eklenecek ilaç deneyleri yaparken doğru bir şekilde ölçülmesi gerekir. Elektrofizyolojik araştırmacı deney bağlı olarak bu sıcaklık değişimi isteyebilirsiniz, ancak tipik olarak, oda sıcaklığında yapılır.
- Hücreler bir Epifloresans mikroskop ile görüntülendi ve izole bir olumlu-transfekte, yeşil yapışık hücre görüş alanının ortasında merkezli.
- Yama pipet kullanarak yama pipet elektrot ve referans elektrot arasındaki devreyi tamamlar mikromanipülatör, banyo çözüm içine düşürdü. PClamp10.1 yazılım banyo modunda iken, pipet ve referans elektrot arasındaki küçük tekrarlayan gerilim adımları oluşturmak için amplifikatör nedenleri, ve kare dalga iz (Şekil 8A) olarak ortaya çıkan akım görüntüler. Bu kare dalga iz, bir hücre önce amplifikatör yama ofset pipet kullanarak zeroed olmalıdır. Pipet direnç pClamp10.1 yazılım tarafından ölçülür ve 2-5MΩ içinde olmalıdır.
- Banyo modunda iken, pipet kare dalga izini hızlı dalgalanmalar olarak görüntülenebilmekte hücre, yakın getirilen, daha sonra küçük bir miktarda emme yama pipet pipet ve bir gigaohm mühür formu için uygulanır membran (kare dalga izini tam bir düz hat neden olur; Şekil 8B).
- Program daha sonra yama modu açıldığında ve pipet kapasitans (düz akım izlemesi baştaki ve sondaki kenarlarında küçük çömezler akım olarak görünür; Şekil 8B) amplifikatör pipet kapasitans tazminat ile telafi.
- Emme küçük ama keskin bir miktar yama membran rüptürü uygulanan ve hücrenin içine elektrod erişim için izin vermek. Başarılı membran rüptürü, aynı zamanda önde gelen ve mevcut dalga iz kenarları (Şekil 8C) sondaki büyük kapasitif Transientlerin görünümünü tarafından gösterilir. Bir kez elde edilmiştir kırmaya, program, hücre modu ve tüm hücre kapasitesi tazminat açıldığında kapasitif transientler kaldırmak için amplifikatör ayarlanır. Kayıttan önce hücre içine, hücre içi kayıt çözüm dengeleme izin vermek için birkaç dakikalık bir gecikme yoktur.
- Voltaj komutları üretilir ve veri pClamp10.1 yazılımı ile birlikte bir Digidata 1440A analog-dijital dönüştürücü arabirimi ile donatılmış bir bilgisayar kullanılarak elde edilir. Benzersiz gerilim kelepçe protokoller her bir deney için yazılır ve bu transfekte hücrelerin iyon kanal akımları kaydetmek için kullanılır. Şekil 9, omurgasız LCav3 voltaj bağımlı kalsiyum kanal ifade bir HEK-293T hücre kaydedilen kalsiyum akımları göstermektedir. Hücre-110mV bir gerilim yapıldı ve 20 mV 70mV arasında artan depolarisations içe kalsiyum akımlarının ortaya götürüldü.
- Kaydedilen akımları 10 kHz kullanarak bir low-pass Bessel filtre filtre ve 2 kHz'lik bir örnekleme frekansında sayısallaştırılmıştır. Minimal sızıntısı (<% 10) Sadece kayıtları analiz için kullanılır, ve çevrimdışı kaçak çıkarma Clampfit 10.1 yazılımı kullanılarak yapılmaktadır.
Kaydedilen hücrelerinin 4.6 İlaç çalışmaları
İlaçlar doğrudan kaydedilen çanak pipetlenir olabilir. Uyuşturucu miktarındaki eklenir ve banyo solüsyonu hacmi bilinen ilaç konsantrasyonu hesaplanabilir. Pahalı ya da sınırlı miktarda ilaç, aynı zamanda teflon vanalar aracılığıyla işletilen ya da sekiz kanal Smartsquirt basınç mikro perfüzyon sistemi (AutoMate Bilimsel) veya yerçekimi akış sistemi kullanarak, 250 mikron çıkarılabilir ucu ile perfüzyon kalem poliimid multi-barrel manifoldu microperfusion eklenebilir Valvelink8 valf denetleyicileri (Bilimsel AutoMate; perfüzyon sistemi kurulumları için bkz. Şekil 5). Perfüzyon kalem kaydedilen hücre 400 mikron çıkmadan bir dere dakikada 0.1ml microperfusion sistemleri Akış hızları ayarlanır. Kayıt elektrot ucu perfüzyon kalem ucu mesafe yama yama tutarlı olmalıdır; Şekil 10 40x büyütme görünür önerilen mesafeyi göstermektedir. Yeterli akış oranları kaydedilen hücre doyurarak perfüzyon sağlar. Önce bir ilaç deneyi microperfusion kullanılarak yapılır, hücreler sürekli bir akış kontrolü banyo çözüm microperfusion ile dengelenmiş. Minimal kesinti akışı hızlı anahtarlama kontrol hamamı, uyuşturucu veya yıkama solüsyonu ile deney sırasında kaçınılmalıdır. Emme kayıt yemeğin kenarına monte t kullanılabiliro bir şırınga ya da peristaltik bir pompa tahrik cihazı (örneğin MINISTAR Minyatür DC Peristaltik Pompa, Dünya Hassas Aletler) kullanarak el ile emme yoluyla çözüm taşması çıkarın. Son derece hızlı perfüzyon, kalsiyum akımı değiştirebilir kesme kuvvetleri indükler beri dikkatli olmalıdır (Peng ve ark 2005), kaydedilen hücre yıkayacak ve ilaç haznesi çok çabuk tüketir.
Doğrudan çanak vs perfüzyon sistemleri içine pipeting
| Doğrudan pipetleme | Mikro Perfüzyon sistemi | Yerçekimi akışı perfüzyon sistemi | |
| Cilt ilaç gerekli | Orta | Düşük | Yüksek |
| Teknik beceri | Düşük | Orta | Orta |
| Ekipman maliyeti | Düşük | Önemli | Önemli |
| Kurulum ve temizlik Günlük Zaman | Hiçbiri | 20 + dakika | 20 + dakika |
| Ekipman kontaminasyonu | Hiçbiri | Evet | Evet |
| Sorun Giderme | Kolay | Karmaşık | Karmaşık |
| Çanak Garantili ilaç | Evet | Yok | Yok |
| Ilaç ilavesi ile hücre Lose | Evet | Evet | Evet |
| Ilaç kons büyük ölçüde azaltır. yıkanarak | Zor | Basit | Basit |
| Çoklu doz yanıt eğrisi yapmanın kolaylığı | Optimal daha az | Basit | Basit |
| Sonuçların tekrarlanabilirliği | Tamam - pippeting yeri bağımlı | Iyi | Iyi |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Açıklanan protokolleri ve çözümleri kullanarak tam hücreli akımları kaydetmek mümkün transfeksiyon başarılı oldu ve istenen gerilim-kapılı iyon kanalları ya da iyon kanal kompleksleri hücre zarının önemli miktarda mevcut olduğunu gösterir. Hücreleri olumlu transfekte (yani floresan yeşil) ama kaydedilebilir akımları, ek süre 28 ° C düzgün bir şekilde paketlenmiş ve hücre zarının içine eklenecek kanal protein için izin istenebilir yok edilmelidir. Uzun süreli inkübasyon 28 ° C, yama kelepçe kayıt daha zorlu hale hücreleri lamelleri ayırmak neden olur, ve membranlar, ölü hücreleri enkaz istikrarsızlaştırmak ve birikir. Bu protokol önerilen tüm zamanların belirli kanallar için optimize edilmiştir. Diğer kanallar ve onların alt birimden daha uzun veya daha kısa inkübasyon sürelerinde gerektirebilir, ve gerektiği gibi bizim protokol daha ayarlanabilir. Bazı kanallar için zayıf transfeksiyon verimlilik (yani daha az floresan hücre ve hücre başına daha düşük floresan), verimli transfekte, yüksek floresan hücreleri daha iyi sonuçlar üretir. Gerektiğini hücreleri floresan ancak kaydedilebilir akımları, düşünülmesi gereken sorun giderme noktaları var: aksesuar protein (ler) eksikliği; transfeksiyon ayıraçları karıştırma uygunsuz alt-optimal kayıt çözümleri ve kanal ya da kanal mutasyon / rekombinasyon yanlış üreten cDNA yapıları subunit katlanmış veya non-ifade kanal.
Şekil 1: İnsan embriyonik böbrek 293T hücreleri (HEK-293T)% 90 confluency Bacalı 25cm2 şişeler CO2 inkübatörler 37oC (% 5 CO2) yapışık mono tabakaları büyüdü ve 01:12, 01:08 ve 01:04 bölünmüş dilüsyonları. Hücreler genellikle ~ 90% confluency, iki haftada ikiye ayrılıyor. ~% 90 benzer bir bölme az confluency sağlamak için, hücre Pazartesi günleri 01:08 seyreltme bölünmüş ve Perşembe günleri 01:12. Transfeksiyon için, önce tamamen konfluent balonuna yeni bir balona 1:4 bölünmüş, ve hücreler 37 ° C'de 3-4 saat için bir CO2 inkübatör takmak için izin verilir.
Şekil 2: HEK-293T iyon kanalları heterolog ifade Stratejisi (Sol) İyon kanal cDNAs plazmid pIRES2 EGFP çoklu klonlama siteye klonlanmış. (Sağ) HEK eGFP kodlama sırası (yeşil); dizisi kodlama iyon kanalı (kırmızı) bir iç ribozom giriş yeri sadece upstream (mavi IRES) içeren mRNA moleküllerinin üretim hücreleri sonuçları bu yapıları Transfeksiyon. EGFP çevrilir ve sitoplazma olarak muhafaza ederken, İyon kanalları, tercüme ve ER ve endomembrane sistemi aracılığı ile hücre zarı için mekik.
Şekil 3: Transfeksiyon HEK-293T hücreler heterolog iyon kanalı cDNAs ve elektrofizyolojik kayıt için lamelleri üzerine hücreler kaplama ifade (A) (Top panelleri) HEK-293T hücreleri 28 inkübe C ile dört gün sonrası transfeksiyon pIRES2 EGFP memeli CMV ifade vektör beslemişlerdir LCav3 kalsiyum kanalları. (Alt paneller) Yukarıdaki hücreleri tripsinize ve cam lamelleri üzerindeki kaplama, elektrofizyolojik kayıt için izole. Diferansiyel Girişim Kontrast mikroskobu (DIC).
Şekil 4: Tipik bir elektrofizyolojik kayıt kulesi kurulum elektrofizyolojik kayıt platformu bileşenleri bir amplifikatör (A), kişisel bilgisayar (PC), Digidata 1440A analog-dijital dönüştürücü arayüzü (C), motorlu, çift pipet manipülatörler (PM), Epifloresans bir mikroskobu (M), perfüzyon sistemleri (P), TMC 63-500 serisi titreşim izolasyonu tablosu (VT), 40 uzun boylu Tip II Faraday Kafesi (FC) ve free-standing 19 metal, elektrik raf (R).
Şekil 5: Perfüzyon sistemleri (A) ağırlık akış sistemi Teflon vana ve Valvelink8 denetleyicileri işletilmektedir. (B) Sekiz kanallı Smartsquirt basınç mikro perfüzyon sistemi. Ya da perfüzyon sistemi Çok Namlulu Manifold İpucu motorlu bir manipülatör monte edilir.
Şekil 6: 10x (solda) ve 40x (sağ) büyütmede gösterilen Parlak, yama pipetler Patch pipetler, borosilikat camdan kılcal tüpler filament ve pipet yüzeyleri pürüzsüz cilalı yangın ile üretilmiştir . Bir pipet-çektirmenin programı bizim elektrofizyoloji set-up 2-5MΩ bir okuma verdi pipetler oluşturmak için optimize edilmiştir.
2314fig7.jpg "alt =" rakam 7 "/>
Şekil 7: Zemin elektrot ve kayıt çözümü kayıt çanak yama pipetler Patch pipet (sağda) ve toprak elektrot (beyaz ok sol).
Şekil 8: pClamp10.1 banyo modunda bir yama yapma adımları gösteren ekran görüntüleri (A) Kare dalga iz görülmektedir. (B) yama modunda bir Gigaohm mühür, akım, düz akım izlemesi baştaki ve sondaki kenarlarında küçük çömezler olarak görünür pipet kapasitans kare dalga iz bir düzleşme yol açar. (C) hücre modunda atılım ve bir süre sonra, büyük kapasitif transientler görülür.
Şekil 9: Elektrofizyoloji sonuçları (Sol) Kaydedilebilir içe voltaj bağımlı kalsiyum akımları heterolog iyon kanallarının başarılı transfeksiyon ve anlatım (örneğin LCav3) gösterir. (Sağ) Untransfected hücreleri hiçbir kaydedilebilir akımlar var. Hücreler yazılım hücre-110mV tutun ve sonra, sonra geri-110mV potansiyeli tutarak 250msec to-70mV adım olduğunu belirten bir IV protokole tabi tutuldu. Her zaman bir adım son adım +20 mV kadar adımları to-70mV-60mV vb böylece 10mV artar. Sonuçlar LCav3 L. stagnalis omurgalı (Cav3) T-tipi voltaj bağımlı kalsiyum kanal homolog olarak adlandırılır.
Şekil 10: elektrotlar ve kayıt çözümü microperfusion kalem Düzenlemesi (A) Patch pipetler borosilikat cam (sağ) hazırlanmış ve ilaç perfüzyon için çok varil manifoldu ucu (sol) poliimid. 3M CSCL ve% 1.5 agaroz çözüm dolu borosilikat cam Zemin elektrot (arka), hokey sopası Mikroelektrod Tutucu Half-Hücreleri düzenlenen eğildi. (B) perfüzyon kalem ucu ve kayıt mikroelektrot bir mikroskop ile 40x görünümü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Doğa Bilimleri ve JDS Discovery İşletim Grant tarafından desteklenen Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Kanada, NSERC Alexander Graham Bell Kanada Yüksek Lisans Bursu (doktora) (A SENATORE) ve Kalp ve İnme Vakfı, Hibe # 6284 NA-In-Aid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIRES2-EGFP plasmid | Clontech Laboratories | 6029-1 | |
| Circle glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 | Circles No. 1 - 0.13 to 0.17mm thick, Size: 12mm |
| Amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B or Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Electrophysiology Software | Axon Instruments | pClamp10.1 | |
| Pipette manipulators | Sutter Instrument Co. | MPC-385-2 | |
| Epifluorescence inverted microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axiovert 40 CFL | |
| Headstage | Axon Instruments | CV-7B | |
| Headstage electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Micr–lectrode holder for ground electrode | World Precision Instruments, Inc. | MEH3RF 15 | |
| Electrophysiology capillary tubes | Sutter Instrument Co. | BF-150-86-15 | Borosilicate glass with filament, O.D. 1.5mm, O.D. 0.86mm, 15cm long |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Micropipette fire polisher | Narishige International | Micro Forge MF-830 | |
| Micro drug perfusion system | AutoMate Scientific, Inc. | SmartSquirt8 Valvelink8.2 | |
| Drug perfusion system | AutoMate Scientific, Inc. | Valvelink8.2 with Teflon valves |
References
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).
- Senatore, A., Spafford, J. D. Transient and big are key features of an invertebrate T-type channel (LCav3) from the central nervous system of Lymnaea stagnalis. Journal of Biological Chemistry. 285, 7447-7458 (2010).
- Ogden, D., Stanfield, P. Patch clamp techniques for single channel and whole-cell recording. Microelectrode techniques: the Plymouth workshop handbook. , The Company of Biologists. Cambridge. (1987).
- Molleman, A. Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology. , John Wiley & Sons Ltd. England. (2003).
- Peng, S. -Q., Hajela, R. K., Atchison, W. D. Fluid flow-induced increase in inward Ba2+ current expressed in HEK293 cells transiently transfected with human neuronal L-type Ca2+channels. Brain Research. 1045, 116-123 (2005).
