Ensaio de vitro de metilação tRNA com a Entamoeba histolytica DNA e Dnmt2 tRNA metiltransferase (Ehmeth) Enzyme
Summary
Este protocolo descreve a preparação de um substrato sintético para o tRNA<em> Entamoeba histolytica</em> DNA / tRNA metiltransferase 2 (Dnmt2) Ehmeth homólogo ea medida de sua atividade metiltransferase. Esta abordagem experimental pode ser usado para investigar a atividade de outras proteínas Dnmt2.
Abstract
Protozoários estão entre os agentes infecciosos mais devastador dos seres humanos responsáveis por uma variedade de doenças como amebíase, que é uma das três causas mais comuns de morte por doenças parasitárias. O agente de amebíase é a ameba Entamoeba histolytica parasita que existe em duas etapas: o cisto infecciosa encontrada em alimentos ou água e os vivos trofozoíto invasivos no intestino. As manifestações clínicas da amebíase gama de ser assintomática a abscessos disenteria, colite ou fígado. E. histolytica é um dos raros parasitas unicelulares com 5-metilcitosina (5mC) em seu genoma. 1, 2 Ela contém uma única DNA metiltransferase, Ehmeth, que pertence à família Dnmt2. duas Um papel para Dnmt2 no controle de elementos repetitivos tem foram estabelecidas em E. histolytica, 3 Dictyostelium discoideum 4,5 e Drosophila. 6 Nosso trabalho recente mostrou que Ehmeth methylates tRNA Asp, e este achado indica que esta enzima tem um DNA dual / tRNA Asp atividade metiltransferase. 7 Esta observação está de acordo com a atividade dupla que tem sido relatada por D. discoideum e D. melanogaster. 8 O significado funcional da especificidade DNA / tRNA de Dnmt2 enzimas ainda é desconhecida. Para abordar esta questão, um método para determinar a atividade metiltransferase tRNA de Dnmt2 proteínas foi estabelecida. Neste vídeo, descrevemos uma abordagem simples de preparar um substrato adequado para tRNA Dnmt2 e um método para medir sua atividade metiltransferase tRNA.
Protocol
Discussion
Nesta apresentação, ilustramos como preparar componentes ativos para a medida da atividade metiltransferase tRNA de E. histolytica enzima Ehmeth. Este procedimento pode servir como um ponto de partida e ser facilmente adaptado para a medida de metiltransferases tRNA outros. É importante seguir os procedimentos que preservem a qualidade ea integridade do substrato tRNA e da proteína tRNA metiltransferase para garantir uma medida óptima da atividade enzimática.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi suportado por concessões do Ciência Israel Foundation e do Instituto da Família Rappaport de Pesquisas de Ciências Médicas e da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Taq Polymerase (5 U/μl) | Rapidozym, Berlin | GEN-003-1000 | ||
| 10X Gentherm PCR Buffer | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | ||
| MgCl2 (50 mM) | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | ||
| dNTP mix (10 mM) | Fermentas, St. Leon-Rot | R0191 | ||
| Oligo nucleotides | IBA, Göttingen | Customized | ||
| NTP mix (25mM) | Fermentas, St. Leon-Rot | R0481 | ||
| GelRed Nucleic Acid Stain 3X in water | Biotium | 41001 | ||
| Dithiotreitol | Fermentas, St. Leon-Rot | R0861 | ||
| Spermidine | Sigma, Germany | S0266 | ||
| Pall Nanosep 0.45 μm | Sigma, Germany | Z722014 | ||
| Dichlorodimethylsilane | Sigma, Germany | 40140 | ||
| Ethanol (Ph. Eur.) | Roth, Karlsruhe | 5054.3 | ||
| Tris HCl | Roth, Karlsruhe | 9090.3 | ||
| Tris | Roth, Karlsruhe | AE15.1 | ||
| BSA | Fermentas, St. Leon-Rot | B14 | ||
| Triton X-100 | Sigma, Germany | T8787 | ||
| TEMED | Roth, Karlsruhe | 2367.1 | ||
| Ammonium Peroxodisulfate | Roth, Karlsruhe | 9592.2 | ||
| Rotiphorese Sequencing gel concentrate | Roth, Karlsruhe | 3043.1 | ||
| Rotiphorese Sequencing gel diluent | Roth, Karlsruhe | 3047.1 | ||
| Rotiphorese Sequencing gel buffer concentrate | Roth, Karlsruhe | 3050.1 | ||
| Rotiphorese 10X TBE-buffer | Roth, Karlsruhe | 3061.2 | ||
| DEPC | Sigma | D5758 | ||
| RNAse ExTERMINATOR | Biological Industry Beit Haemek | 01-895-1B | ||
| Ampicillin | Sigma | A0166 | ||
| IPTG | Sigma | I6758 | ||
| PMSF | Sigma | P7626 | ||
| Lysozyme | Sigma | L7651 | ||
| Leupeptine | Sigma | L2884 | ||
| Benzonase Nuclease | Novagen | 70746-3 | ||
| BugBuster protein extraction reagent | Novagen | 70921-3 | ||
| Glutathione-agarose resin | Sigma | G4510 | ||
| L-glutathione reduced | Sigma | G4251 | ||
| AdoMet | New England Biolabs | B9003 | ||
| AdoMet 3H | PerkinElmer | NET155250UC | ||
| Scintillation Cocktail | CytoScint | 882453 |
Referências
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