Bu protokol hazırlanması için sentetik bir tRNA substrat açıklar<em> Entamoeba histolytica</em> DNA / tRNA metiltransferaz 2 (Dnmt2) homolog Ehmeth ve metil faaliyet ölçüsüdür. Bu deneysel bir yaklaşım, diğer Dnmt2 proteinlerin aktivitesini araştırmak için kullanılabilir.
Protozoa parazitler amebiasis, paraziter hastalık ölüm üç en yaygın nedenlerinden biri de dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların sorumlu insanların en yıkıcı enfeksiyöz ajanlar arasında yer almaktadır. Amebiyazis ajan iki aşamada altında var olan amip parazit Entamoeba histolytica: enfektif kisti, bağırsak gıda ya da su ve invaziv trophozoite yaşam bulundu . Asemptomatik kolit, dizanteri veya karaciğer abseleri amebiasis aralığının klinik bulgular E. histolytica nadir tek hücreli parazitin biri kendi genom 5-methylcytosine (5MC) ile 1, 2 Dnmt2 ailesine ait metiltransferaz tek bir DNA Ehmeth, içerir. 2 tekrarlayan elemanlarla kontrol Dnmt2 bir rol E. kurulmuştur histolytica, 3 Diktiyostelyum diskodeyum 4,5 ve Drosophila 6 Bizim son iş bu Ehmeth metiller tRNA Asp gösterdi ve bu bulgu, bu enzim bir çift DNA / tRNA Asp metiltransferaz aktivitesi olduğunu göstermektedir. 7 Bu gözlem çift aktivite ile anlaşma D. bildirilmiştir diskodeyum ve D. melanogaster. Dnmt2 enzimler DNA / tRNA özgüllüğü 8 fonksiyonel önemi hala bilinmiyor. Bu soruya cevap için, Dnmt2 proteinler tRNA metiltransferaz etkinliğini belirlemek için bir yöntem kurulmuştur. Bu video, Dnmt2 için yeterli bir tRNA substrat hazırlamak için basit bir yaklaşımdır ve tRNA metiltransferaz aktivitesini ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır.
Bu sunumda, E. tRNA metiltransferaz aktivite ölçmek için aktif bileşenleri nasıl hazırlanacağını gösterildiği histolytica Ehmeth enzim. Bu prosedür, bir başlangıç noktası olarak hizmet edebilir ve diğer tRNA methyltransferases ölçmek için kolayca adapte edilebilir. TRNA substrat ve tRNA metiltransferaz protein kalitesini ve bütünlüğünü korumak enzimatik aktivite optimal bir ölçüsü sigorta işlemlerini takip etmek önemlidir.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, İsrail Bilim Vakfı ve Rappaport Aile Enstitüsü Tıp Bilimleri Araştırma ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) hibe tarafından desteklenen oldu.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Taq Polymerase (5 U/μl) | Rapidozym, Berlin | GEN-003-1000 | ||
10X Gentherm PCR Buffer | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | ||
MgCl2 (50 mM) | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | ||
dNTP mix (10 mM) | Fermentas, St. Leon-Rot | R0191 | ||
Oligo nucleotides | IBA, Göttingen | Customized | ||
NTP mix (25mM) | Fermentas, St. Leon-Rot | R0481 | ||
GelRed Nucleic Acid Stain 3X in water | Biotium | 41001 | ||
Dithiotreitol | Fermentas, St. Leon-Rot | R0861 | ||
Spermidine | Sigma, Germany | S0266 | ||
Pall Nanosep 0.45 μm | Sigma, Germany | Z722014 | ||
Dichlorodimethylsilane | Sigma, Germany | 40140 | ||
Ethanol (Ph. Eur.) | Roth, Karlsruhe | 5054.3 | ||
Tris HCl | Roth, Karlsruhe | 9090.3 | ||
Tris | Roth, Karlsruhe | AE15.1 | ||
BSA | Fermentas, St. Leon-Rot | B14 | ||
Triton X-100 | Sigma, Germany | T8787 | ||
TEMED | Roth, Karlsruhe | 2367.1 | ||
Ammonium Peroxodisulfate | Roth, Karlsruhe | 9592.2 | ||
Rotiphorese Sequencing gel concentrate | Roth, Karlsruhe | 3043.1 | ||
Rotiphorese Sequencing gel diluent | Roth, Karlsruhe | 3047.1 | ||
Rotiphorese Sequencing gel buffer concentrate | Roth, Karlsruhe | 3050.1 | ||
Rotiphorese 10X TBE-buffer | Roth, Karlsruhe | 3061.2 | ||
DEPC | Sigma | D5758 | ||
RNAse ExTERMINATOR | Biological Industry Beit Haemek | 01-895-1B | ||
Ampicillin | Sigma | A0166 | ||
IPTG | Sigma | I6758 | ||
PMSF | Sigma | P7626 | ||
Lysozyme | Sigma | L7651 | ||
Leupeptine | Sigma | L2884 | ||
Benzonase Nuclease | Novagen | 70746-3 | ||
BugBuster protein extraction reagent | Novagen | 70921-3 | ||
Glutathione-agarose resin | Sigma | G4510 | ||
L-glutathione reduced | Sigma | G4251 | ||
AdoMet | New England Biolabs | B9003 | ||
AdoMet 3H | PerkinElmer | NET155250UC | ||
Scintillation Cocktail | CytoScint | 882453 |