Test in vitro Metilazione tRNA con l'Entamoeba histolytica del DNA e Dnmt2 tRNA metiltransferasi (Ehmeth) Enzyme
Summary
Questo protocollo descrive la preparazione di un substrato sintetico per il tRNA<em> Entamoeba histolytica</em> DNA / tRNA metiltransferasi 2 (Dnmt2) Ehmeth omologa e la misura della sua attività metiltransferasi. Questo approccio sperimentale può essere utilizzato per indagare l'attività di altre proteine Dnmt2.
Abstract
Protozoi parassiti sono tra gli agenti infettivi più devastanti degli esseri umani responsabili di una varietà di malattie tra cui amebiasi, che è una delle tre più comuni cause di morte per malattie parassitarie. L'agente di amebiasi è l'ameba parassita Entamoeba histolytica che esiste in due fasi: la cisti infettive presenti nel cibo o acqua e la vita trofozoite invasivo a livello intestinale. Le manifestazioni cliniche della gamma amebiasi da essere asintomatica per ascessi colite, dissenteria o di fegato. E. histolytica è uno dei rari parassita unicellulare con 5-metilcitosina (5mC) nel suo genoma. 1, 2 contiene un singolo DNA metiltransferasi, Ehmeth, che appartiene alla famiglia Dnmt2. 2 Un ruolo per Dnmt2 nel controllo di elementi ripetitivi ha stato stabilito in E. histolytica, 3 Dictyostelium discoideum 4,5 e Drosophila. 6 I nostri lavori più recenti hanno dimostrato che Ehmeth metila tRNA Asp, e questo dato indica che questo enzima ha un DNA a doppia / tRNA attività Asp metiltransferasi. 7 Questa osservazione è in accordo con la duplice attività che è stato segnalato per D. discoideum e D. melanogaster. 8 Il significato funzionale del DNA / tRNA specificità del Dnmt2 enzimi è ancora sconosciuta. Per affrontare questo problema, un metodo per determinare l'attività metiltransferasi tRNA Dnmt2 di proteine è stata stabilita. In questo video, si descrive un approccio semplice per preparare un adeguato substrato tRNA per Dnmt2 e un metodo per misurare la sua attività metiltransferasi tRNA.
Protocol
Discussion
In questa presentazione, abbiamo illustrato come preparare componenti attivi per la misura dell'attività tRNA metiltransferasi di E. histolytica Ehmeth enzima. Questa procedura può servire come punto di partenza ed essere facilmente adattato per la misura della metiltransferasi tRNA altri. E 'importante seguire le procedure che preservano la qualità e l'integrità del substrato tRNA e della proteina tRNA metiltransferasi per assicurare una misura ottimale della attività enzimatica.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato anche da finanziamenti la Israel Science Foundation e l'Istituto per la Famiglia Rappaport ricerca nelle scienze mediche, e la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Taq Polymerase (5 U/μl) | Rapidozym, Berlin | GEN-003-1000 | ||
| 10X Gentherm PCR Buffer | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | ||
| MgCl2 (50 mM) | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | ||
| dNTP mix (10 mM) | Fermentas, St. Leon-Rot | R0191 | ||
| Oligo nucleotides | IBA, Göttingen | Customized | ||
| NTP mix (25mM) | Fermentas, St. Leon-Rot | R0481 | ||
| GelRed Nucleic Acid Stain 3X in water | Biotium | 41001 | ||
| Dithiotreitol | Fermentas, St. Leon-Rot | R0861 | ||
| Spermidine | Sigma, Germany | S0266 | ||
| Pall Nanosep 0.45 μm | Sigma, Germany | Z722014 | ||
| Dichlorodimethylsilane | Sigma, Germany | 40140 | ||
| Ethanol (Ph. Eur.) | Roth, Karlsruhe | 5054.3 | ||
| Tris HCl | Roth, Karlsruhe | 9090.3 | ||
| Tris | Roth, Karlsruhe | AE15.1 | ||
| BSA | Fermentas, St. Leon-Rot | B14 | ||
| Triton X-100 | Sigma, Germany | T8787 | ||
| TEMED | Roth, Karlsruhe | 2367.1 | ||
| Ammonium Peroxodisulfate | Roth, Karlsruhe | 9592.2 | ||
| Rotiphorese Sequencing gel concentrate | Roth, Karlsruhe | 3043.1 | ||
| Rotiphorese Sequencing gel diluent | Roth, Karlsruhe | 3047.1 | ||
| Rotiphorese Sequencing gel buffer concentrate | Roth, Karlsruhe | 3050.1 | ||
| Rotiphorese 10X TBE-buffer | Roth, Karlsruhe | 3061.2 | ||
| DEPC | Sigma | D5758 | ||
| RNAse ExTERMINATOR | Biological Industry Beit Haemek | 01-895-1B | ||
| Ampicillin | Sigma | A0166 | ||
| IPTG | Sigma | I6758 | ||
| PMSF | Sigma | P7626 | ||
| Lysozyme | Sigma | L7651 | ||
| Leupeptine | Sigma | L2884 | ||
| Benzonase Nuclease | Novagen | 70746-3 | ||
| BugBuster protein extraction reagent | Novagen | 70921-3 | ||
| Glutathione-agarose resin | Sigma | G4510 | ||
| L-glutathione reduced | Sigma | G4251 | ||
| AdoMet | New England Biolabs | B9003 | ||
| AdoMet 3H | PerkinElmer | NET155250UC | ||
| Scintillation Cocktail | CytoScint | 882453 |
Referências
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