Entamoeba histolytica DNA와 tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) 효소를 체외 tRNA의 Methylation 분석에서
Summary
이 프로토콜은의 합성 tRNA 기판의 준비에 대해 설명합니다<em> Entamoeba histolytica</em> DNA / tRNA methyltransferase 2 (Dnmt2) 상동체의 Ehmeth과 methyltransferase 활동의 측정합니다. 이 실험 방법은 다른 Dnmt2 단백질의 활동을 조사하고 사용할 수 있습니다.
Abstract
Protozoan의 기생충이 기생 질병에서 죽음의 세 가지 가장 일반적인 원인 중 하나입니다 amebiasis 포함한 질병의 다양한 책임을 인간의 가장 치명적인 전염성 에이전트 사이에 있습니다. amebiasis의 에이전트는 두 단계 아래에 존재하는 아메바 Entamoeba histolytica 기생충입니다 infective의 낭종은 소장에서 음식이나 물 침입 trophozoite 생활에서 발견했습니다. asymptomatic되는 대장염, 이질 또는 간 농양에 amebiasis 범위의 임상 발현. E. histolytica는 게놈의 5 methylcytosine (5mC)과 함께 진귀한 단세포 기생충 중 하나입니다. 1, 2, 그것은 Dnmt2 가족에 속하는 methyltransferase 단일 DNA, Ehmeth을 포함합니다. 2 반복 요소의 제어 Dnmt2에 대한 역할을했다 E. 년에 설립되었습니다 histolytica, 3 Dictyostelium의 discoideum 4,5와 Drosophila는 6. 우리의 최근 작업은 Ehmeth methylates tRNA ASP 나타났습니다,이 발견은이 효소가 이중 DNA / tRNA ASP methyltransferase 활동을했음을 나타냅니다. 7이 관찰 듀얼 활동 계약에 D.에 대한보고되었음을 discoideum와 D. melanogaster. Dnmt2 효소의 DNA / tRNA 특이성 8 기능적 중요성은 아직 알 수있다. 이 질문을 해결하기 위해, Dnmt2 단백질의 tRNA methyltransferase 활동을 결정하는 방법이 설립되었습니다. 이 비디오에서 우리는 Dnmt2위한 적절한 tRNA 기판을 준비하는 간단한 방법과 tRNA methyltransferase 활동을 측정하는 방법을 설명합니다.
Protocol
Discussion
이 프레 젠 테이션에서, 우리는 E.의 tRNA methyltransferase 활동의 측정에 대한 활성 구성 요소를 준비하는 방법을 그림 histolytica Ehmeth 효소. 이 절차를 시작 지점으로 사용할 수 있으며, 쉽게 다른 tRNA의 methyltransferases의 측정에 대한 적응. 효소 활동의 최적의 조치를 확보하기 위해 tRNA 기판과 tRNA methyltransferase 단백질의 품질과 무결성을 보존 절차를 수행하는 것이 중요합니다.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 이스라엘 과학 재단과 의료 과학 연구를위한 Rappaport 가족 연구소 및 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG)에서 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Taq Polymerase (5 U/μl) | Rapidozym, Berlin | GEN-003-1000 | ||
| 10X Gentherm PCR Buffer | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | ||
| MgCl2 (50 mM) | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | ||
| dNTP mix (10 mM) | Fermentas, St. Leon-Rot | R0191 | ||
| Oligo nucleotides | IBA, Göttingen | Customized | ||
| NTP mix (25mM) | Fermentas, St. Leon-Rot | R0481 | ||
| GelRed Nucleic Acid Stain 3X in water | Biotium | 41001 | ||
| Dithiotreitol | Fermentas, St. Leon-Rot | R0861 | ||
| Spermidine | Sigma, Germany | S0266 | ||
| Pall Nanosep 0.45 μm | Sigma, Germany | Z722014 | ||
| Dichlorodimethylsilane | Sigma, Germany | 40140 | ||
| Ethanol (Ph. Eur.) | Roth, Karlsruhe | 5054.3 | ||
| Tris HCl | Roth, Karlsruhe | 9090.3 | ||
| Tris | Roth, Karlsruhe | AE15.1 | ||
| BSA | Fermentas, St. Leon-Rot | B14 | ||
| Triton X-100 | Sigma, Germany | T8787 | ||
| TEMED | Roth, Karlsruhe | 2367.1 | ||
| Ammonium Peroxodisulfate | Roth, Karlsruhe | 9592.2 | ||
| Rotiphorese Sequencing gel concentrate | Roth, Karlsruhe | 3043.1 | ||
| Rotiphorese Sequencing gel diluent | Roth, Karlsruhe | 3047.1 | ||
| Rotiphorese Sequencing gel buffer concentrate | Roth, Karlsruhe | 3050.1 | ||
| Rotiphorese 10X TBE-buffer | Roth, Karlsruhe | 3061.2 | ||
| DEPC | Sigma | D5758 | ||
| RNAse ExTERMINATOR | Biological Industry Beit Haemek | 01-895-1B | ||
| Ampicillin | Sigma | A0166 | ||
| IPTG | Sigma | I6758 | ||
| PMSF | Sigma | P7626 | ||
| Lysozyme | Sigma | L7651 | ||
| Leupeptine | Sigma | L2884 | ||
| Benzonase Nuclease | Novagen | 70746-3 | ||
| BugBuster protein extraction reagent | Novagen | 70921-3 | ||
| Glutathione-agarose resin | Sigma | G4510 | ||
| L-glutathione reduced | Sigma | G4251 | ||
| AdoMet | New England Biolabs | B9003 | ||
| AdoMet 3H | PerkinElmer | NET155250UC | ||
| Scintillation Cocktail | CytoScint | 882453 |
Referências
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