Summary
这一协议描述为抗击非典研究重组受体结合域（RBD）为基础的亚单位疫苗的一般程序。它包括RBD的蛋白在293T细胞中，免疫与RBD的小鼠，检测小鼠血清中和使用建立非典pseudovirus中和试验活动的转染和表达方法。
Abstract
基于其安全性和诱导抗感染的免疫反应的能力，亚单位疫苗已被用来作为候选人为多种病原体 1-3 。由于哺乳动物细胞系统的能力，从而形成正确折叠和糖基化蛋白质翻译后修饰，在哺乳动物细胞中表达的重组蛋白都表现出了极大的潜力，以保持较高的抗原性和免疫原性4-6。
自2004年以来，虽然没有发现新病例的SARS疫情的是一个恒定的威胁，因此，对SARS冠状病毒疫苗的发展是一个审慎的预防的步骤，并应进行。 RBD的SARS - CoV的S蛋白在受体结合，诱导特异性中和抗体对病毒感染7-9扮演重要的角色。因此，在这个协议中，我们描述发展RBD的亚单位疫苗，对SARS的新方法。简单地说，RBD的重组蛋白（rRBD）在培养的哺乳动物293T细胞培养上清表示，获得正确的构型和高免疫原性6正确折叠的蛋白质。的RBD的重组质粒转染的细胞，然后使用一些修改一个磷酸钙转染法6,10。 11,12与脂质转染法相比，这个修改过的磷酸钙转染法是更便宜，更容易处理，有可能达到疗效高，一旦形成一个合适的大小和形状的转复杂13,14。最后，在协议中引入综合症pseudovirus中和试验，用于检测rRBD蛋白免疫小鼠血清中和活性。此实验是比较安全的，不涉及传染性的SARS冠状病毒，并可以不执行了一个生物安全实验室 15的要求。
这里所描述的协议也可以用来设计和研究I类融合蛋白的重组亚单位疫苗，对其他病毒，例如，艾滋病毒，呼吸道合胞病毒（RSV），埃博拉病毒，流感病毒，以及尼帕和Handra病毒。此外，产生pseudovirus和随后建立pseudovirus中和试验方法可以适用于所有这些病毒。
Protocol
1。重组SARS - CoV的RBD的蛋白制备
- 准备磷酸钙转染试剂
- 2X哈佛商学院的缓冲液配制：16克氯化钠，0.4克的Na 2 HPO 4 7H 2 O，13.0克HEPES混合在一起。调整pH值至7.00，并带来总量1000毫升蒸馏水中。经过过滤消毒，分装解决方案，并储存在-20 ° C
提示：任何pH值的变化会影响转染结果。因此，最好是来测试几个pH值约7.00（例如，6.99，7.00，7.01），并找到最好使用下面介绍的方法转染。 - 2.5米氯化钙2准备：在终体积为200毫升添加73.5克的氯化钙2 · 2H 2 O蒸馏水。过滤器的解决方案，并储存在-20 ° C
- 2X哈佛商学院的缓冲液配制：16克氯化钠，0.4克的Na 2 HPO 4 7H 2 O，13.0克HEPES混合在一起。调整pH值至7.00，并带来总量1000毫升蒸馏水中。经过过滤消毒，分装解决方案，并储存在-20 ° C
- 重组质粒转染和蛋白的纯化
- 分割前汇合24 h转染293T细胞在50-70％。成长中的T - 175厘米2组织在40毫升的DMEM含10％热灭活胎牛血清和1％青霉素/链霉素（P / S）在37 ° 5％的CO 2（HI）的彗星的培养瓶中的细胞。
- 应使所有的转染试剂室温染前。这些试剂包括哈佛商学院的2倍，2.5M 氯化钙 ，DIH 2 O，和rRBD质粒6。
提示：最后的重组质粒构建用于蛋白表达，应该包含一个信号肽，以确保培养上清分泌表达的重组蛋白。可能会增加6倍His标签易于纯化的表达蛋白C -末端。 - 准备之一50毫升（A）和一个15毫升（b）屋宇署猎鹰管，并加试剂如表1所示的管。 A.管B管加入2X哈佛商学院的缓冲区，加2.5M 氯化钙和rRBD质粒，并带来DIH 2 O量的要求
表1转染混合物制备和卷A.一个T - 175厘米2组织培养瓶（4000μL/烧瓶）：准备rRBD表达 管中 管B 2X哈佛商学院 2000微升 2.5M氯化钙2 200微升 rRBD质粒DNA 40微克 DIH 2 O来 2000微升 B.一个100毫米的培养皿（1000μL/皿）：SARS pseudovirus生产准备 管中 管B 2X哈佛商学院 500μL， 2.5M氯化钙2 50微升 SARS - CoV的S质粒DNA 5微克 HIV - 1质粒（pNL4 3.luc.RE） 5微克 DIH 2 O来 500μL，
在表1中列出的卷是一个转单位。如果更多的烧瓶或菜肴用于转染，卷相应的调整。 - 添加到管中滴加方式一管B的DNA钙的解决方案，同时保持常数和温柔的一个旋涡混合。让混合物在室温下坐20-30分钟。磷酸钙转染成功的关键取决于形成的沉淀物的大小和形状。因此，应混合振荡不断，慢慢地满足这一要求，因此，提高转染疗效。
- 在滴加甚至添加到293T细胞（4000微升/瓶）的混合物。培养细胞在37 ° C在5％CO2培养箱中培养。
- 更换新鲜的无血清的OPTI - MEM我降低血清中（50毫升/瓶）8-10 h后转染培养液中。两个多天在相同条件下，继续培养细胞。
- 收集上清含有表示rRBD蛋白72 h后转染。在15分钟6000转离心去除细胞碎片。添加蛋白酶抑制剂的鸡尾酒收集上清和储存在4 ° C过夜。
- 第二天，从培养上清净化rRBD重组蛋白，用镍NTA Superflow以下制造商的指示。
- 使用Amicon超-15浓度管浓缩纯化蛋白质。蛋白浓度后，添加PBS的浓度管和离心机再次删除咪唑洗脱缓冲液。计算蛋白浓度和纯化蛋白质在-80 ° C，直到使用的存储。
2。小鼠免疫及样品采集
- 预温西格玛辅助系统（SAS）40-45 ° C，符合制造商的说明。加入1每ml小瓶PBS调匀。
- 根据表2中的协议，准备蛋白佐剂乳化。移液器计算为1.5毫升管rRBD蛋白质。加入同等体积的SAS辅助大力为2-3分钟，以形成乳化液管和涡。
提示：在表2中列出的卷是一个鼠标。调整卷，根据实际使用的鼠标号码。对于每个组，每一种疫苗所需的蛋白质和辅助混合在一起。疫苗接种，以确保准确性，始终准备一个额外的样品。
表2。小鼠免疫协议集团 第1次疫苗
（200μL/鼠标）第2 次疫苗
（200μL/鼠标）第3 次疫苗
（200μL/鼠标）rRBD蛋白 20μg蛋白在PBS
（100μL）+ 100μL的SAS10μg蛋白在PBS（100μL）+ 100μL的SAS 10μg蛋白在PBS（100μL）+ 100μL的SAS PBS对照 100μL的PBS +
100μL的SAS100μL的PBS +
100μL的SAS100μL的PBS +
100μL的SAS - 皮下注射免疫总理的雌性BALB / c小鼠（4-6周龄，5只/组），并加强与rRBD和SAS两次如表2所示。 PBS作为对照组。皮下注射的网站通常选择的肩胛骨之间的皮肤松弛。此外，腹部腹面是常用的，因为它更容易注入，并可能会观察到从注射部位的任何泄漏。当使用重复剂量的疫苗，它是很容易来选择不同的注射部位，防止潜在的局部皮肤反应。
- 流血通过眼窝每个接种疫苗的免疫接种后10天前与麻醉剂，并在56 ° C下30分钟热血清灭活补体小鼠。商店小鼠血清于-20 ° C，直到使用。
3。中和检测，使用Pseudovirus中和试验
- 准备非典pseudovirus
- 293T细胞分裂100毫米的组织培养培养皿（2 × 10 6细胞/皿）转染前16小时，和成长细胞如上。
- 准备转染试剂，如表1所示。联合转染质粒编码SARS冠状病毒S蛋白和环境保护缺陷，质粒编码荧光素酶表达的HIV - 1的基因组（pNL4 3.luc.RE）使用磷酸钙转染试剂。
- 更换新鲜DMEM培养液10毫升含10％胎牛血清和1％的P / S 8-10小时后转染介质。收集上清含有非典pseudovirus 72小时后转。
- 通过0.45μm滤膜过滤pseudovirus。分装和储存在-80 ° C，直到使用。
- 非典pseudovirus中和试验
- 分割293T细胞表达在SARS病毒受体ACE2的（ACE2/293T）10 4 cells/100μL/孔，96孔组织培养板16小时前感染。
- 稀释2倍SARS pseudovirus ACE2/293T细胞检测病毒滴度。
- 串行稀释的小鼠血清中的96孔组织培养板，加等体积滴定非典pseudovirus。在37 ° C，1小时Preincubate板
- 孵育后，加入100μL血清pseudovirus混合ACE2/293T细胞，并继续增长，细胞在37 ° 5％的CO 2的彗星。加入新鲜的DMEM培养24 h后。
- 彻底清除板从培养上清感染后72 h。添加1X荧光素酶细胞培养裂解试剂（60μL/孔），并不断摇动板在室温下1-2 h促进细胞裂解。
- 转移细胞裂解液（50μL/孔）进入光度计板（Microfluor 96孔板）。加入荧光素酶检测系统中的荧光素酶底物（50微升/孔），超384光度计检测相对荧光素酶的活性。
- 非典pseudovirus中和效价和目前计算为50％的中和抗体滴度（NT 50）6 。
Discussion
细胞密度是一个重要因素，影响磷酸钙为基础的转的疗效。根据我们的经验，低于70％的细胞汇合带来最好的结果。因此，为了提高转染效率，建议保持在约50-70％汇合，细胞密度。磷酸钙转染法一般被认为与其他转染方法，如脂质转染16相比，效率较低。然而，在这个协议中，我们使用一个修改过的磷酸钙转染法，即常数和慢转的解决方案中的一个旋涡混合确保适当的大小和形状形成沉淀，从而提高转染效率。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
支持这项研究是由美国国立卫生研究院（NIH）的美国（RO1 AI68002）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Na2HPO4*7H2O | Sigma-Aldrich | S2429 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| CaCl2*2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| DMEM | Invitrogen | 12430 | |
| HI FBS | Invitrogen | 10438 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| OPTI-MEM I Medium | Invitrogen | 31985 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11836170001 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30450 | |
| Sigma adjuvant system | Sigma-Aldrich | S6322 | |
| Luciferase assay system | Promega Corp. | E1501 | |
| Luciferase cell culture lysis reagent (5X) | Promega Corp. | E1531 | |
| Amicon Ultra - 15 | EMD Millipore | UFC901024 | |
| Microfluor 96-well plates | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 7905 | |
| Ultra 384 luminometer | Tecan Group Ltd. |
References
- Pitcovski, J., Gutter, B., Gallili, G., Goldway, M., Perelman, B., Gross, G., Krispel, S., Barbakov, M., Michael, A. Development and large-scale use of recombinant VP2 vaccine for the prevention of infectious bursal disease of chickens. Vaccine. 21, 4736-4743 (2003).
- Tait, A., Hall, F. R. Theileria annulata: control measures, diagnosis and the potential use of subunit vaccines. Rev. Sci. Tech. 9, 387-403 (1990).
- Qi, Z., Zhou, L., Zhang, Q., Ren, L., Dai, R., Wu, B., Wang, T., Zhu, Z., Yang, Y., Cui, B., Wang, Z., Wang, H., Qiu, Y., Guo, Z., Yang, R., Wang, X. Comparison of mouse, guinea pig and rabbit models for evaluation of plague subunit vaccine F1+rV270. Vaccine. 28, 1655-1660 (2010).
- Rosser, M. P., Xia, W., Hartsell, S., McCaman, M., Zhu, Y., Wang, S., Harvey, S., Bringmann, P., Cobb, R. R. Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system. Protein Expr. Purif. 40, 237-243 (2005).
- Du, L., Zhao, G., Li, L., He, Y., Zhou, Y., Zheng, B. J., Jiang, S. Antigenicity and immunogenicity of SARS-CoV S protein receptor-binding domain stably expressed in CHO cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 384, 486-490 (2009).
- Du, L., Zhao, G., Chan, C. C., Sun, S., Chen, M., Liu, Z., Guo, H., He, Y., Zhou, Y., Zheng, B. J., Jiang, S. Recombinant receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein expressed in mammalian, insect and E. coli cells elicits potent neutralizing antibody and protective immunity. Virology. 393, 144-150 (2009).
- Ambrosino, D. M. Amino acids 270 to 510 of the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein are required for interaction with receptor. J. Virol. 78, 4552-4560 (2004).
- Li, W., Moore, M. J., Vasilieva, N., Sui, J., Wong, S. K., Berne, M. A., Somasundaran, M., Sullivan, J. L., Luzuriaga, K., Greenough, T. C., Choe, H., Farzan, M. Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus. Nature. 426, 450-454 (2003).
- He, Y., Zhou, Y., Liu, S., Kou, Z., Li, W., Farzan, M., Jiang, S. Receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein induces highly potent neutralizing antibodies: implication for developing subunit vaccine. Biochem. Biophys. Res. Commun. 324, 773-781 (2004).
- Batard, P., Jordan, M., Wurm, F. Transfer of high copy number plasmid into mammalian cells by calcium phosphate transfection. Gene. 270, 61-68 (2001).
- Pramfalk, C., Lanner, J., Andersson, M., Danielsson, E., Kaiser, C., Renstrom, I. M., Warolen, M., James, S. R. Insulin receptor activation and down-regulation by cationic lipid transfection reagents. BMC. Cell Biol. 5, 7-7 (2004).
- Rosser, M. P., Xia, W., Hartsell, S., McCaman, M., Zhu, Y., Wang, S., Harvey, S., Bringmann, P., Cobb, R. R. Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system. Protein Expr. Purif. 40, 237-243 (2005).
- Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).
- Jiang, M., Deng, L., Chen, G. High Ca(2+)-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis. Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).
- Han, D. P., Kim, H. G., Kim, Y. B., Poon, L. L., Cho, M. W. Development of a safe neutralization assay for SARS-CoV and characterization of S-glycoprotein. Virology. 326, 140-149 (2004).
- Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors. Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).
