Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Protocol voor Recombinant RBD-based SARS Vaccins: Eiwit Voorbereiding, vaccinatie van dieren en het onschadelijk maken Detectie

Published: May 2, 2011 doi: 10.3791/2444
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Lindsley F. Kimball Research Institute, New York Blood Center

Summary

Dit protocol beschrijft een algemene procedure voor het bestuderen van recombinante receptor-bindend domein (RBD)-gebaseerde subunit vaccins tegen SARS. Het bevat methoden voor transfectie en expressie van de RBD eiwit in 293T-cellen, immunisatie van muizen met RBD en detectie van de neutralisatie activiteit van muis-sera met behulp van een gevestigde SARS pseudovirus neutralisatie assay.

Abstract

Op basis van hun veiligheidsprofiel en het vermogen om krachtige immuunrespons te induceren tegen infecties, zijn subunit vaccins gebruikt als kandidaten voor een breed scala van ziekteverwekkers 1-3. Aangezien het zoogdiercellen systeem in staat is van post-translationele modificatie, en vormen zo correct gevouwen en geglycosyleerde eiwitten, hebben recombinante eiwitten, uitgedrukt in cellen van zoogdieren aangetoond dat het grootste potentieel om hoge antigeniciteit en immunogeniciteit 4-6 te houden.

Hoewel er geen nieuwe gevallen van SARS zijn gemeld sinds 2004, toekomstige uitbraken vormen een constante bedreiging, dus de ontwikkeling van vaccins tegen SARS-CoV is een voorzichtige stap en preventief moeten worden uitgevoerd. De RBD van eiwit SARS-CoV S speelt een belangrijke rol in receptor binding en inductie van specifieke neutraliserende antilichamen tegen het virus 7-9. Daarom is in dit protocol beschrijven we nieuwe methoden voor het ontwikkelen van een RBD-gebaseerde subunit vaccin tegen SARS. In het kort, was het recombinante eiwit RBD (rRBD) uitgedrukt in kweeksupernatant van zoogdieren 293T-cellen om een correct gevouwen eiwit te verkrijgen met de juiste exterieur en hoge immunogeniciteit 6. De transfectie van de recombinant plasmide coderend RBD aan de cellen werd vervolgens uitgevoerd met behulp van een calciumfosfaat transfectie methode 6,10 met enkele wijzigingen. Vergeleken met de lipide transfectie methode 11,12, deze aangepaste calciumfosfaat transfectie methode is goedkoper, gemakkelijker te hanteren, en heeft het potentieel om hoge effectiviteit te bereiken eens een transfectie complex met geschikte grootte en vorm wordt gevormd 13,14. Tot slot werd een SARS pseudovirus neutralisatietest geïntroduceerd in het protocol en wordt gebruikt om de neutraliserende activiteit van sera van muizen gevaccineerd met rRBD eiwit te detecteren. Deze test is relatief veilig, geen sprake van een besmettelijke SARS-CoV, en kan worden uitgevoerd zonder de vereiste van een bioveiligheid-3 laboratorium 15.

Het protocol hier beschreven kan ook worden gebruikt voor het ontwerpen en bestuderen recombinant subunit vaccins tegen andere virussen die van klasse I fusie-eiwitten, zoals HIV, respiratoir syncytieel virus (RSV), Ebola virus, influenza virus, evenals Nipah en Handra virussen. Daarnaast kunnen de methoden voor het genereren van een pseudovirus en vervolgens tot vaststelling van een pseudovirus neutralisatie assay worden toegepast op al deze virussen.

Protocol

1. Recombinant SARS-CoV RBD eiwitpreparaat

  1. Bereid calciumfosfaat transfectie reagens
    1. 2X HBS buffer voorbereiding: Meng 16 g NaCl, 0,4 g Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, en 13,0 g HEPES. Pas de pH op 7,00 en brengen het totale volume tot 1000 ml in gedestilleerd water. Na het filteren van de oplossing voor sterilisatie, hoeveelheid en op te slaan bij -20 ° C.
      Hint: Een wijziging van de pH-waarde zou invloed hebben op de transfectie resultaten. Zo is het raadzaam om verschillende pH-waarden te testen rond 7.00 (bijvoorbeeld 6.99, 7.00 of 7.01) en de beste voor de transfectie met behulp van de onderstaande methode geïntroduceerd te vinden.
    2. 2.5 M CaCl 2 bereiding: Voeg 73,5 g CaCl 2 * 2H 2 O tot gedistilleerd water in een uiteindelijk volume van 200 ml. Filtreer de oplossing en bewaar bij -20 ° C.
  2. Recombinant plasmide transfectie en eiwit zuivering
    1. Split 293T cellen bij 50-70% confluentie 24 uur voor transfectie. Groeien cellen in T-175 cm 2 weefselkweek flessen in 40 ml DMEM met 10% hitte-geïnactiveerd (HI) FBS en 1% penicilline / streptomycine (P / S) bij 37 ° C in 5% CO 2.
    2. Alle transfectiereagentia moet worden gebracht tot kamertemperatuur voordat transfectie. Deze reagentia zijn 2X HBS, 2,5 M CaCl 2, dih 2 O, en rRBD plasmide 6.
      Hint: De laatste recombinant plasmide construct gebruikt voor proteïne-expressie moet een signaal peptide bevatten om de uitscheiding van geuit recombinante eiwitten ervoor te zorgen dat de cultuur supernatant. Een 6x Zijn tag kunnen worden toegevoegd aan de C-terminal van de tot expressie gebrachte eiwit voor een gemakkelijke reiniging.
    3. Bereid een 50 ml (A) en een 15 ml (B) BD Falcon buis, en voeg reagentia aan de buizen zoals aangegeven in tabel 1. Voeg 2X HBS buffer om buis A. In buis B, voeg 2.5M CaCl 2 en rRBD plasmide, en breng het volume op de eis in dih 2 O.
      A. Een T-175 cm 2 weefselkweek kolf (4000 pi / fles): voor te bereiden op rRBD expressie
      Een buis Buis B
      2X HBS 2000 pi 2.5M CaCl 2 200 pi
      rRBD plasmide DNA 40 ug
      Dih 2 O te 2000 pi
      B. Een 100-mm petrischaal (1000 pi / gerecht): voor te bereiden op SARS pseudovirus productie
      Een buis Buis B
      2X HBS 500 pL 2.5M CaCl 2 50 uL
      Plasmide DNA SARS-CoV S 5 microgram
      HIV-1 plasmide (pNL4-3.luc.RE) 5 microgram
      Dih 2 O te 500 pL
      Tabel 1. Transfectie mengsel voorbereiding en volumes
      De volumes in tabel 1 zijn voor een transfectie-eenheid. Als er meer kolven of schotels worden gebruikt voor de transfectie, dienovereenkomstig aan te passen volumes.
    4. Voeg de DNA-calcium-oplossing in buis B in buis A in een druppelsgewijze manier, met behoud van een constante en voorzichtig mengen in een vortex. Laat het mengsel op kamertemperatuur komen voor 20-30 minuten. De sleutel voor succesvolle calciumfosfaat transfectie is afhankelijk van de grootte en de vorm van de gevormde neerslag. Daarom moet het mengsel voortdurend en langzaam worden gevortext aan deze eis te voldoen, en als gevolg daarvan, transfectie efficiëntie te verbeteren.
    5. Voeg het mengsel in een druppelsgewijs en zelfs manier in 293T-cellen (4000 pi / fles). Cultuur-cellen in de broedstoof bij 37 ° C in 5% CO 2.
    6. Vervang het kweekmedium met verse serumvrij OPTI-MEM I Reduced-Serum Medium (50 ml / fles) 80-10 uur na transfectie. Blijf cultuur cellen voor twee dagen in dezelfde staat.
    7. Verzamel supernatant bevat uitgedrukt rRBD eiwit 72 uur na transfectie. Centrifugeer bij 6000 rpm gedurende 15 min naar cel vuil te verwijderen. Voeg proteaseremmer cocktail om de verzamelde supernatant en bewaar bij 4 ° C gedurende de nacht.
    8. Op de volgende dagen, te zuiveren rRBD recombinant eiwit uit het kweeksupernatant gebruik van Ni-NTA Superflow volgende instructies van de fabrikant.
    9. Concentreer gezuiverde eiwit met behulp van Amicon Ultra -15 concentratie buizen. Na de eiwitconcentratie,Voeg PBS met de concentratie en centrifugeer weer naar imidazol te verwijderen elutiebuffer. Bereken eiwitconcentratie en op te slaan gezuiverd eiwit bij -80 ° C tot gebruik.

2. Muis Immunisatie en Sample Collection

  1. Pre-warm Sigma adjuvant systeem (SAS) tot 40-45 ° C volgens de instructies van de fabrikant. Voeg 1 mL PBS per flesje en meng.
  2. Bereid eiwit-adjuvante emulsie volgens het protocol in tabel 2. Pipetteer berekend rRBD eiwit in een 1,5 ml buis. Voeg gelijk volume van SAS adjuvant aan de buis en de vortex krachtig voor 2-3 min om emulsie te vormen.
    Hint: De volumes in tabel 2 zijn voor een muis. Het volume aanpassen op basis van de feitelijk gebruikte muis nummers. Voor elke groep, Meng de eiwitten en adjuvant vereist voor elke vaccin. Altijd bereidt u een extra steekproef voor de vaccinatie om de nauwkeurigheid te garanderen.
    Groep 1 st vaccin
    (200 ul / muis)     		2 e vaccin
    (200 ul / muis)     		3 e vaccin
    (200 ul / muis)
    rRBD eiwit 20 pg eiwit in PBS
    (100 pi) + 100 pi SAS     		10 ug eiwit in PBS (100 pi) + 100 pi SAS 10 ug eiwit in PBS (100 pi) + 100 pi SAS
    PBS-controle 100 pi PBS +
    100 ul SAS     		100 pi PBS +
    100 ul SAS     		100 pi PBS +
    100 ul SAS
    Tabel 2. Mouse immunisatieprotocol
  3. Subcutaan prime-immuniseren vrouwelijke BALB / c muizen (4-6 weken oud, 5 muizen / groep), en boost tweemaal met rRBD en SAS zoals aangegeven in tabel 2. Gebruik PBS groep als de controle. De site voor subcutane injecties meestal gekozen is de losse huid tussen de schouderbladen. Als alternatief wordt de ventrale buik vaak gebruikt, omdat het gemakkelijker is om te injecteren, en mag de lekkage van de injectieplaatsen te observeren. Wanneer herhaalde doses vaccins worden gebruikt, is het gemakkelijk om te kiezen verschillende injectieplaatsen, het voorkomen van potentiële lokale huidreacties.
  4. Bleed muizen via retro-orbitale met verdoving voor immunisatie en 10 dagen na elke vaccinatie, en warmte sera bij 56 ° C gedurende 30 minuten tot het complement te inactiveren. Bewaar muis sera bij -20 ° C tot gebruik.

3. Neutralisatie Detectie met behulp van Pseudovirus neutralisatie assay

  1. Bereid SARS pseudovirus
    1. Split 293T cellen in 100 mm weefselkweek petrischalen (2x10 6 cellen / schaaltje) 16 uur voor transfectie, en te groeien cellen zoals hierboven.
    2. Bereid transfectiereagentia zoals aangegeven in tabel 1. Co-transfecteren een plasmide coderend voor SARS-CoV S eiwit en een plasmide coderend voor Env-defect is, luciferase-expressie HIV-1 genoom (pNL4-3.luc.RE) met behulp van calciumfosfaat transfectie reagens.
    3. Vervangen door medium met 10 ml vers DMEM met 10% FBS en 1% P / S 80-10 uur na transfectie. Verzamel supernatant met SARS pseudovirus 72 uur na transfectie.
    4. Filter pseudovirus door een 0,45 urn filter. Aliquot en bewaar bij -80 ° C tot gebruik.
  2. SARS pseudovirus neutralisatie assay
    1. Split 293T cellen die SARS-CoV receptor ACE2 (ACE2/293T) op 10 4 cells/100 ul / putje in 96-well kultuurplaten 16 uur vóór infectie.
    2. Verdunnen SARS pseudovirus 2-voudig om het virus titer te detecteren in ACE2/293T cellen.
    3. Serieel te verdunnen muis sera in 96-well kultuur platen, en voeg gelijk volume van het gestelde SARS pseudovirus. Preincubate de platen bij 37 ° C gedurende 1 uur
    4. Na de incubatie, voeg 100 ul van de sera-pseudovirus mengsel aan ACE2/293T cellen, en blijven cellen groeien bij 37 ° C in 5% CO 2. Later toe te voegen verse DMEM 24 uur.
    5. Volledig kweeksupernatanten te verwijderen van de platen 72 uur na infectie. Voeg 1X luciferase celkweek lysis reagens (60 ul / putje), en het bevorderen van cel-lysis met een constante schudden van de platen gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur.
    6. Transfer cellysaten (50 ul / putje) in luminometer platen (Microfluor 96-well platen). Voeg luciferase substraat (50 ul / putje) opgenomen in luciferase assay systeem en detecteert de relatieve luciferase-activiteit in de Ultra 384 luminometer.
    7. Bereken SARS pseudovirus neutralisatie titer en aanwezig als 50% neutraliserende antilichamen titer (NT 50) 6.

Discussion

Celdichtheid is een belangrijke factor die de effectiviteit van calciumfosfaat-gebaseerde transfectie. In onze ervaring, minder dan 70% confluentie van de cellen brengt de beste resultaten. Dus, om de transfectie-efficiëntie te verbeteren, wordt aanbevolen dat celdichtheid worden bewaard bij ca. 50-70% van de confluentie. De calciumfosfaat transfectie methode wordt meestal gedacht dat minder efficiënt worden vergeleken met andere transfectie methoden, zoals lipide transfectie 16. Echter, in dit protocol, gebruikten we een aangepaste calciumfosfaat transfectie methode waarbij constant en langzaam mengen van de transfectie oplossing in een draaikolk de vorming van een neerslag zorgt ervoor dat met de juiste grootte en vorm, waardoor het verbeteren van transfectie-efficiëntie.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) van de Verenigde Staten (RO1 AI68002).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Sigma-Aldrich S7653
Na2HPO4*7H2O Sigma-Aldrich S2429
HEPES Sigma-Aldrich H3375
CaCl2*2H2O Sigma-Aldrich C5080
DMEM Invitrogen 12430
HI FBS Invitrogen 10438
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140
OPTI-MEM I Medium Invitrogen 31985
Protease inhibitor cocktail Roche Group 11836170001
Ni-NTA Superflow Qiagen 30450
Sigma adjuvant system Sigma-Aldrich S6322
Luciferase assay system Promega Corp. E1501
Luciferase cell culture lysis reagent (5X) Promega Corp. E1531
Amicon Ultra - 15 EMD Millipore UFC901024
Microfluor 96-well plates Thermo Fisher Scientific, Inc. 7905
Ultra 384 luminometer Tecan Group Ltd.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pitcovski, J., Gutter, B., Gallili, G., Goldway, M., Perelman, B., Gross, G., Krispel, S., Barbakov, M., Michael, A. Development and large-scale use of recombinant VP2 vaccine for the prevention of infectious bursal disease of chickens. Vaccine. 21, 4736-4743 (2003).
  2. Tait, A., Hall, F. R. Theileria annulata: control measures, diagnosis and the potential use of subunit vaccines. Rev. Sci. Tech. 9, 387-403 (1990).
  3. Qi, Z., Zhou, L., Zhang, Q., Ren, L., Dai, R., Wu, B., Wang, T., Zhu, Z., Yang, Y., Cui, B., Wang, Z., Wang, H., Qiu, Y., Guo, Z., Yang, R., Wang, X. Comparison of mouse, guinea pig and rabbit models for evaluation of plague subunit vaccine F1+rV270. Vaccine. 28, 1655-1660 (2010).
  4. Rosser, M. P., Xia, W., Hartsell, S., McCaman, M., Zhu, Y., Wang, S., Harvey, S., Bringmann, P., Cobb, R. R. Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system. Protein Expr. Purif. 40, 237-243 (2005).
  5. Du, L., Zhao, G., Li, L., He, Y., Zhou, Y., Zheng, B. J., Jiang, S. Antigenicity and immunogenicity of SARS-CoV S protein receptor-binding domain stably expressed in CHO cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 384, 486-490 (2009).
  6. Du, L., Zhao, G., Chan, C. C., Sun, S., Chen, M., Liu, Z., Guo, H., He, Y., Zhou, Y., Zheng, B. J., Jiang, S. Recombinant receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein expressed in mammalian, insect and E. coli cells elicits potent neutralizing antibody and protective immunity. Virology. 393, 144-150 (2009).
  7. Ambrosino, D. M. Amino acids 270 to 510 of the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein are required for interaction with receptor. J. Virol. 78, 4552-4560 (2004).
  8. Li, W., Moore, M. J., Vasilieva, N., Sui, J., Wong, S. K., Berne, M. A., Somasundaran, M., Sullivan, J. L., Luzuriaga, K., Greenough, T. C., Choe, H., Farzan, M. Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus. Nature. 426, 450-454 (2003).
  9. He, Y., Zhou, Y., Liu, S., Kou, Z., Li, W., Farzan, M., Jiang, S. Receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein induces highly potent neutralizing antibodies: implication for developing subunit vaccine. Biochem. Biophys. Res. Commun. 324, 773-781 (2004).
  10. Batard, P., Jordan, M., Wurm, F. Transfer of high copy number plasmid into mammalian cells by calcium phosphate transfection. Gene. 270, 61-68 (2001).
  11. Pramfalk, C., Lanner, J., Andersson, M., Danielsson, E., Kaiser, C., Renstrom, I. M., Warolen, M., James, S. R. Insulin receptor activation and down-regulation by cationic lipid transfection reagents. BMC. Cell Biol. 5, 7-7 (2004).
  12. Rosser, M. P., Xia, W., Hartsell, S., McCaman, M., Zhu, Y., Wang, S., Harvey, S., Bringmann, P., Cobb, R. R. Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system. Protein Expr. Purif. 40, 237-243 (2005).
  13. Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).
  14. Jiang, M., Deng, L., Chen, G. High Ca(2+)-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis. Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).
  15. Han, D. P., Kim, H. G., Kim, Y. B., Poon, L. L., Cho, M. W. Development of a safe neutralization assay for SARS-CoV and characterization of S-glycoprotein. Virology. 326, 140-149 (2004).
  16. Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors. Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).

Tags

Immunologie SARS receptor-bindend domein subunit vaccins immunisatie neutralisatie detectie
Protocol voor Recombinant RBD-based SARS Vaccins: Eiwit Voorbereiding, vaccinatie van dieren en het onschadelijk maken Detectie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Du, L., Zhang, X., Liu, J., Jiang,… More

Du, L., Zhang, X., Liu, J., Jiang, S. Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection. J. Vis. Exp. (51), e2444, doi:10.3791/2444 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter