Summary
분자 프로브 PicoGreen 염료와 microplate 리더 액세서리를 갖춘 히타치 F - 7000 형광 분광 광도계를 사용하여 dsDNA의 부량의 데모.
Abstract
특히 작은 농도의 DNA,의 부량는 합성과 정화의 DNA 등 유전자 증폭 제품의 부량 등 진단 응용 프로그램 및 약물의 DNA 분자의 탐지와 같은 표준 분자 생물학의 assays 포함하여 생물 학적 응용 프로그램의 다양한 중요한 작업입니다 준비. 이 비디오를 동안 우리는 분자 프로브 퀀트 - 그것 PicoGreen 염색 시약 키트를 사용하여 dsDNA의 부량을 수행하는 마이크로 플레이트 리더 액세서리 갖춘 히타치 F - 7000 형광 분광 광도계의 능력을 보여주는 것입니다.
F - 7000 형광 분광 광도계는 고감도 및 고속 측정을 제공합니다. 그것은 측정 형광, 발광과 인광 수있는 매우 유연한 시스템입니다. 몇 가지 측정 모드 파장 스캔, 시간 검색, 측광 및 3 - D 검사 측정을 포함하여, 사용할 수 있습니다. 분광 광도계는 microplate에 300 μL 샘플 볼륨을 사용할 때 플루오레신 50 picomoles의 범위에서 감도를 가지고 있으며, 60,000 NM / 분의 스캔 속도를 측정할 수있다. 또한 최대 농도의 넓은 범위의 보정 곡선의 사용을 허용 규모의 5 주문 다양한 동적 범위가 있습니다. 광학 시스템은 최대 에너지와 감성에 대한 모든 반사 광학을 사용합니다. 표준 파장 범위는 200-750 nm의이며, 옵션 근처 적외선 photomultipliers 중 하나를 사용할 때 900 nm의로 확장될 수 있습니다. 이 시스템은 옵션으로 외부 온도 조절 액체 순환 장치를 사용하여 섭씨 5-60도에서 플레이트 리더를위한 선택 온도 제어를 허용합니다. microplate 리더 96 잘 microplates의 사용을 허용하고, 반응 속도론 모드를 사용하는 경우 96 우물에 대한 측정 속도보다 60 초입니다.
F - 7000 및 Microplate 리더를위한 소프트웨어 컨트롤도 매우 유연합니다. 샘플은 열 또는 행에 형식 중 하나에서 설정 수 있으며, 우물의 조합은 샘플 측정 선택할 수 있습니다. 이것은 microplate의 최적 활용을 허용합니다. 또한, 소프트웨어는 마이크로 Excel에서 만든 쉼표로 구분된 값에 저장된 판 샘플 구성 또는 "CSV"포맷을 가져올 수 있습니다. Microplate 측정 구성이 저장되고 편의를위한 소프트웨어 및 생산성 향상으로 리콜 수 있습니다. 데이터 결과는 표준 보고서 출력, 엑셀로, 또는 선택적 보고서 생성기 프로그램을 수 있습니다.
Protocol
1. 악기 설정
- spectrofluorometer 켜고 1 시간 동안 워밍업 수 있습니다.
- Excel이 그림 1에 나타난 표준 및 샘플 데이터 파일을 만들고 분리 쉼표에 저장 사용하면 "CSV"형식을 값.
그림 1. 표준 및 샘플 데이터입니다. - 다음과 같이 fluorometer를 설정합니다 :
- 을 클릭
버튼이 그림 2에 표시된 분석 방법 창이 열립니다. 
그림 2. 분석 방법 윈도우, 일반 탭을 클릭합니다.
다음과 같이 선택합니다 :- "측정"필드에서 풀다운 메뉴에서 측광을 선택합니다.
- "연산자"입력란에 해당 운영자의 이름을 입력합니다.
- "악기"입력란에 정보를 입력할 필요가 없습니다. 이것은 소프트웨어에 의해 자동으로 선택됩니다.
- microplate 리더를 사용할 때 "샘플링"필드는 비활성화되어 있습니다.
- 당신이 "의견"입력란에 리포트에 포함시킬 수있는 의견을 입력하십시오.
- "액세서리"입력란에이 시험에 사용되는 부속품에 관한 정보를 입력하십시오.
- 창의 오른쪽에있는 버튼을합니다.
- "로드"버튼을 이전에 저장한 분석 방법을 로딩 있습니다.
- '저장'버튼은 동일한 이름을 사용하여 테스트 매개 변수 또는 이전에 저장한 및로드 분석 방법의 집합을 업데이 트하실 수 있습니다.
- 버튼을 원하는 이름으로 테스트 매개 변수 또는 분석 방법의 새로운 집합을 저장 가능 "다른 이름으로 저장".
그림 3. 분석 방법 윈도우, Quantitation 탭.- "Quantitation 형식"입력란에 파장을 선택합니다. 이것은 형광 읽기가 선택한 파장을 사용하여 이루어집니다 나타냅니다.
- "보정 형식"입력란에 1 일 순서를 선택합니다.
- "파장 번호 '입력란에 1을 선택합니다.
- "농도 단위"필드에서 NG / ML을 입력하십시오.
- "수동 보정"와 "제로를 통해 강제로 곡선"에 대한 확인란을 선택되지 않은 둡니다.
- 입력란에 "소수점 뒤 자리"에서는, 2를 선택합니다.
- "로우어 농도 제한"필드에 0을 입력합니다.
- "어퍼 농도 제한 필드에 10000을 입력합니다.
이제 '악기'탭을 클릭하고 다음과 같이 선택합니다.
그림 4. 분석 방법 창, 인스 트루먼트 탭- "데이터 모드 :"입력란에 형광을 선택합니다.
- "초핑 속도"필드는이 시간에, 그것이 인광 측정에 대해서만 사용되는 운영 중지 상태입니다.
- "파장 모드"필드에서 WL 고정 모두를 선택합니다.
- "EX / WL1 '입력란에 480nm 입력하십시오.
- "EM / WL1"필드에서 520nm를 입력하십시오.
- 다른 모든 EX 아래의 필드와 EM은 현재 운영 중지 상태입니다.
- "EX 슬릿 '입력란에 풀다운 메뉴에서 5.0nm 선택합니다.
- "EM 슬릿 '입력란에 풀다운 메뉴에서 5.0nm 선택합니다.
- "PMT 전압 1 - 1000V '필드 앞에있는 확인란을 선택되지 않은 둡니다.
- "PMT 전압"필드에서 풀다운 메뉴에서 700V를 선택합니다.
- "자동 통계 CALC. 번호"입력란에 2를 선택합니다.
- "복제"입력란에 1을 선택합니다.
- "통합 시간"필드에서 0.1s를 선택합니다. <은/ 리>
- "지연"입력란에 입력하거나 개로 선택하십시오.
그림 5. 분석 방법 창, 모니터 탭을 클릭하십시오.- "Y 축"에서 "최대 :"입력란에 10000을 선택합니다
- 에서 "Y 축", "최소 :"필드에 0을 선택합니다.
- "데이터 수집 후 처리 오픈 데이터"의 왼쪽에있는 확인란을 선택합니다.
- 이 수치가 완료된 후 자동으로 인쇄하기 위해 리포트를 원하지 않으시면 '데이터 수집 후 인쇄 보고서 "의 왼쪽에있는 확인란을 선택되지 않은 둡니다.
그림 6. 분석 방법 창, 보고서 탭.- "출력"필드에서 풀다운 메뉴에서 인쇄 보고서를 선택합니다. 당신은 또한 사용자 정의 만든 리포트를 생성할 수 있습니다 프로그램 보고서 생성기에 선택 추가를 사용하는 경우 Excel로 내보낸 데이터 또는 "사용 인쇄 생성기 시트"를 원한다면 "Microsoft Excel을 사용"을 선택 수 있습니다.
- 이 보고서에 포함 시키고자하는 항목에 대한 상자를 클릭합니다.
- "분석 방법"윈도우의 여러 탭에서 선택한 모든 매개 변수를 저장하려면, ""일반 "탭을 다시 클릭하고 파일 이름으로하고 나중에 사용하기 위해 그것들을 찾을 수있는 위치에 그들을 저장하고,를 클릭 확인 "이 창을 닫습니다 버튼을 누르십시오.
- 이것은 악기 테스트 매개 변수를 설정 완료됩니다.
- 이제 우리는 microplate 리더를 설치합니다.
- 을 클릭
위에 MPR 설치 윈도우가 나타납니다 버튼.
그림 7. MPR 설정 창, 플레이트 탭을 클릭하십시오.- A1 위치를 클릭하고 E1 마우스를 드래그 다음을 클릭합니다
버튼을 클릭합니다. 이것은 표준에 사용되는 위치를 선택합니다. 이러한 순위는 녹색으로 강조 표시됩니다. - 이제 우리는 샘플 H3에 위치의 F1을 선택합니다. 를 누른 다음를 클릭하고 위치 F1부터 마우스를 드래그 H3 위치를하고
버튼이 노란색으로 그 위치를 강조 표시됩니다. - 다음 샘플 측정에 그 위치를 선택하고, E3에 A2 위치에 대해 동일한 작업을 반복합니다.
- 이제 변수 (CSV) 파일을 구분된 파일 쉼표로 표준 및 샘플 정보 사전에 준비를로드하자.
그림 8. MPR 설정 창, 웰 정보 탭을 클릭하십시오.- 다음을 클릭합니다
버튼을 클릭합니다. Windows 탐색기 창을은 "글쎄 information.csv"파일을 찾는 데 그것을 로딩 있도록 그림 9에 표시하는 열립니다. 
그림 9. 물론 샘플 정보를로드 중입니다.
"자 정보"파일을로드 후 "그럼 정보는"그림 10에서 그림과 같이 표시됩니다
그림 10. 샘플 잘 정보를 로드된.
- 을 클릭
버튼이 그림 2에 표시된 분석 방법 창이 열립니다. 
위에 MPR 설치 윈도우가 나타납니다 버튼. 
버튼을 클릭합니다. 이것은 표준에 사용되는 위치를 선택합니다. 이러한 순위는 녹색으로 강조 표시됩니다. 
버튼이 노란색으로 그 위치를 강조 표시됩니다. 
버튼을 클릭합니다. Windows 탐색기 창을은 "글쎄 information.csv"파일을 찾는 데 그것을 로딩 있도록 그림 9에 표시하는 열립니다. 
2. Picogreen 분석 샘플 준비
- 20 X TE 버퍼 1 ML 추가하여 1X TE 버퍼 (10 MM 트리스 - HCL, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 준비19 ML DI H 2 O.
- 9.95 ML 1 X TE 버퍼 50 μL 200 X PicoGreen 시약을 추가하여 PicoGreen 시약 솔루션을 준비합니다.
- 주식 dsDNA (100 μg / ML)의 시리얼 dilutions함으로써 표준 (람다 dsDNA)를 준비합니다. 먼저 주식 dsDNA (100 μg / ML) 25 μL 1 X TE 버퍼 25 μL를 추가하여 50 μg / ML dsDNA의 솔루션을 준비합니다. 그런 다음 아래의 표에 표시된 dsDNA의 볼륨과 버퍼를 추가하여 표준 솔루션을 준비 :
dsDNA의 농도 dsDNA의 볼륨 버퍼의 볼륨 1 μg / ML 50 μg / ML dsDNA 20 μL 980 μL 1 X TE 버퍼 0.1 μg / ML 1 μg / ML dsDNA 100 μL 900 μL 1 X TE 버퍼 0.01 μg / ML 0.1 μg / ML dsDNA 100 μL 900 μL 1 X TE 버퍼 0.001 μg / ML 0.01 μg / ML dsDNA 100 μL 900 μL 1 X TE 버퍼
3. 표준 및 샘플 형광 측정
- 피펫 150 그림 7 당 96 잘 접시의 우물 A1 - E1에 각 표준의 μL, 다음과 같은 테이블에 따라 :
잘 표준 A1 1 μg / ML B1 0.1 μg / ML C1 0.01 μg / ML D1 0.001 μg / ML E1 1 X TE 버퍼 - 그림 7에 표시된 H3에 우물 F1에 피펫 150 μL 알려지지 않은 샘플
- 다중 채널 피펫 사용을 위해 설계된 여물로 단계 1.2 준비 PicoGreen 솔루션을 하거라. 웰스 A1 - H3 150 μL PicoGreen 솔루션을 제공하는 멀티 채널 피펫을 사용합니다. 부드럽게 피펫과 혼합 용액 및 표준.
- 플레이스 어두운 영역 판과 발전에 대한 반응에 대한 2-5분을 기다립니다.
4. 대표 결과
좋은 교정 곡선은 소프트웨어에 의해 보정 곡선의 표준과 계산 측정시 F - 7000 소프트웨어에서 제공하는 다양한 매개 변수를 사용하여 평가됩니다.
결정 계수는 측정 기준에 맞게의 선하심과 계산 보정 곡선을 나타냅니다. 가까이이 값이 "1"로되어 측정값 및 교정 곡선의 더 맞습니다.
값이 "1"에서 멀리 떨어진 경우, 기준, 다시 측정 다시 준비하거나 교정 곡선의 적합성은 변경해야합니다.
그림 11 PicoGreen 염료를 사용하여 dsDNA의 부량 위해 얻은 계산 결정 계수 = 0.99993와 교정 곡선의 예를 보여줍니다.
그림 11. dsDNA 보정 곡선의 예.
Discussion
조심하세요 샘플 준비 중에 pipetting뿐만 아니라 안정적이고 민감한 형광 분광 광도계를 사용하여 좋은 재현성 결과를 얻기 위해 필수적입니다.
이 테스트에 사용된 형광 분광 광도계의 경우, 그것은 microplate 리더 300 μL 최종 샘플 볼륨을 사용하여 제안합니다. 낮은 볼륨 감도를 감소하고, 큰 볼륨 우물 사이의 교차 오염의 원인이 될 수 있습니다.
Disclosures
루이스 A. 모레노와 켄드라 L. 콕스이 문서에서 사용되는 악기를 생산하는 히타치 하이 테크놀로지 미국에 의해 고용됩니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled H2O | Reagent | |||
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit from Invitrogen | Reagent | P7589 | ||
| Nalge Nunc Fluorescence Microplates p/n 237108 | Supply | 237108 | ||
| 12 Channel Eppendorf Micropipette | Supply | 3516677 | ||
| 1000 μL Eppendorf Pipette | Supply | |||
| 200 μL Eppendorf Pipette | Supply | |||
| 10 mL serological pipet | Supply | |||
| Aluminum foil | Supply | |||
| Pipette tips | Supply | |||
| Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer with FL Solutions 2.1 | Equipment | 5J1-0003 | ||
| Microplate Reader Accessory for F-7000 | Equipment | 5J0-0139 |
References
- Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation. Analytical Biochemistry. 249 (2), 228-238 (1997).
