Summary
Демонстрация количественное двухцепочечной ДНК с использованием молекулярных зондов PicoGreen красителя и Hitachi F-7000 флуоресценции Спектрофотометр оснащен аксессуар микропланшетов читателя.
Abstract
Количественная оценка ДНК, особенно в малых концентрациях, является важной задачей с широким спектром биологических приложений, включая стандартные молекулярного анализа биологии, таких как синтеза и очистки ДНК, диагностических приложений, таких как количественная оценка продуктов амплификации ДНК и обнаружение молекул ДНК с наркотиками препаратов. В этом видео мы продемонстрируем возможности Hitachi F-7000 флуоресценции Спектрофотометр оснащен Micro аксессуар чтения пластин для выполнения дцДНК количественного использования молекулярных проб Квант-это PicoGreen красителя реагентов.
F-7000 флуоресценции Спектрофотометр обладает высокой чувствительностью и высоким измерения скорости. Это очень гибкая система, способная измерения флуоресценции, люминесценции и фосфоресценции. Несколько режимов измерений доступны, в том числе длина волны сканирования, время сканирования, фотометрии и 3-D сканирования измерения. Спектрофотометр имеет чувствительность в диапазоне от 50 пикомолей флуоресцеина при использовании 300 мкл объем образца в планшет, и может измерять скорость сканирования 60000 нм / мин. Она также имеет широкий динамический диапазон до 5 порядков, которая позволяет использовать калибровочных кривых в широком диапазоне концентраций. Оптическая система использует все отражающей оптика для максимальной энергии и чувствительности. Стандартный диапазон длин волн от 200 до 750 нм, и может быть расширен до 900 нм при использовании одного из дополнительных ближней инфракрасной фотоумножителей. Система позволяет дополнительно контролировать температуру ридер с 5 до 60 градусов Цельсия с помощью дополнительного внешнего температуры контролируемой жидкости циркулятор. Микропланшетов читателя позволяет использовать 96-а микропланшетов и измерения скорости на 96 лунок составляет менее 60 секунд при использовании режима кинетики.
Программное обеспечение управления для F-7000 и Считыватель микропланшетов также высокой гибкостью. Пробы могут быть установлены либо в столбце или строке форматов, а также любое сочетание скважин могут быть выбраны для выборочных измерений. Это позволяет оптимально использовать планшет. Кроме того, программное обеспечение позволяет импортировать микро образец стекла конфигураций созданных в Excel и сохранить в значения, разделенные запятыми, или "CSV" формат. Микропланшетов измерения конфигурации могут быть сохранены и восстановлены на программное обеспечение для удобства и повышения производительности. Данные результаты могут быть выведены на стандартный отчет, в Excel, или дополнительный Программа генератор отчетов.
Protocol
1. Инструмент установки
- Включите spectrofluorometer и дать прогреться в течение 1 часа.
- Использование Excel создать файл с Стандарты и образцы данных, как показано на рисунке 1 и сохранить его в значения, разделенные запятыми "CSV" формат.
Рисунок 1. Стандарты и образцы данных. - Настройка флуорометр следующим образом:
- Нажмите на
Кнопка, это откроет окно Метод анализа, как показано на рисунке 2. 
Рисунок 2. Метод анализа окна, вкладка Общие.
Сделайте следующие пункты:- В "Измерение" поля, выберите Фотометрия из выпадающего меню.
- В "Оператор" введите имя соответствующего оператора.
- Существует нет необходимости вводить информацию в "Инструмент" поле. Это выбирается автоматически с помощью программного обеспечения.
- "Выборка" поле неактивным при использовании микропланшетного.
- Введите любые комментарии, которые вы можете включить в доклад, в поле "Комментарии".
- В "Аксессуары" введите информацию о принадлежности, используемые для этого теста.
- Обратите внимание на кнопки на правой стороне окна.
- Кнопку "Загрузить" позволяет загружать ранее сохраненные методы анализа.
- Кнопку «Сохранить» позволяет обновлять набор тестовых параметров или Метод анализа ранее сохранены и загружены, используя те же имя.
- "Сохранить как" кнопка позволяет сохранить новый набор параметров испытаний или анализа методом под нужное имя.
Рисунок 3. Метод анализа Window, Количественный вкладке.- В "Количественное определение типа" поля, выберите длин волн. Это указывает на то флуоресценции чтении будет выполнено по выбранной длины волны.
- В "Калибровка типа" поля, выберите 1-го порядка.
- В "Количество длин волн" поле, выберите 1.
- В "Концентрация блок" введите нг / мл.
- Оставьте невыбранной ящики для "Ручная калибровка" и "Форс-кривой, проходящей через ноль".
- В "цифры после запятой" поля, выберите 2.
- В "Нижний концентрационный предел" введите 0.
- В "верхнем поле предельно допустимой концентрации, введите 10000.
Теперь нажмите на "инструмент" на вкладке и сделать следующий выбор.
Рисунок 4. Метод анализа окна инструментов вкладки- В "Данные режим:" поле, выделите флуоресценции.
- "Рубка скорость" поля неактивны в это время, он используется только для измерения фосфоресценции.
- В "Длина волны режиме" поля, выберите Оба WL исправлена.
- В "EX / WL1" введите 480nm.
- В "ЭМ / WL1" введите 520nm.
- Все остальные поля под EX и EM неактивны в это время.
- В "EX щель" поле выбора 5.0nm из выпадающего меню.
- В «ЭМ щель" поле выбора 5.0nm из выпадающего меню.
- Оставьте невыбранной поле перед "PMT напряжения 1-1000" поле.
- В "PMT Voltage" поля, выберите 700V из выпадающего меню.
- В "известково статистики Auto. Числу" поле выбора 2.
- В "Репликация" поле выберите 1.
- В "Время интеграции" поле выбора 0.1с. </ LI>
- В "Задержка" введите или выберите 0s.
Рисунок 5. Метод анализа окна вкладку Монитор.- В "Y оси", "Макс:" поле, выделите 10000
- В "Y оси", "Мин:" поле, выберите 0.
- Установите флажок слева от "Открытого обработки данных после сбора данных".
- Оставьте невыбранной окне слева от "Печать отчета после сбора данных", если вы не хотите доклад, который будет автоматически печатаются после чтений будут завершены.
Рисунок 6. Метод анализа окна, Доклад Tab.- В "Output" поля, выберите Печать отчета из выпадающего меню. Кроме того, можно выбрать "Использовать Microsoft Excel", если вы хотите, чтобы данные экспортируются в Excel, или «Использовать печати Генератор Ведомости", если с помощью дополнительного добавить на программу генератор отчетов, который позволит генерации пользовательских выступили с докладами.
- Нажмите ящики для элементов, которые необходимо включить в отчет.
- Чтобы сохранить все выбранные параметры в разных вкладках "Метод анализа" окно, снова нажмите на вкладку "Общие" и сохранить их под имя файла и в таком месте, где вы могли бы найти их для дальнейшего использования, и нажмите кнопку " ОК ", чтобы закрыть это окно.
- На этом настройка параметров инструмента тестирования.
- Теперь мы будем создавать микропланшетов читателя.
- Нажмите на
Кнопка, которая принесет Window MPR установки сверху.
Рисунок 7. МПР установки окна, плиты вкладке.- Нажмите на позицию А1 и перетащите мышь для E1, а затем нажмите
кнопки. Это позволит выбрать позицию для использования в стандартах. Эти позиции будут выделены зеленым цветом. - Теперь нам нужно выбрать позицию F1, чтобы H3 для образцов. Щелкните и перетащите мышь, начиная с позиции F1, на позицию H3, а затем нажмите
Кнопка, это будет выделить те позиции в желтый цвет. - Затем повторите ту же операцию на должности A2 до E3, чтобы выбрать те позиции для образца измерений.
- Теперь, давайте загрузки файла, разделенных запятыми переменных (CSV) файл подготовлен заранее с Стандарты и образцы информации.
Рисунок 8. МПР установки окна, Ну вкладке Сведения.- Затем нажмите на
кнопки. Окна Windows Explorer откроет которые, как показано на рисунке 9, который позволит размещения "Ну information.csv" файл и загрузить его. 
Рисунок 9. Загрузка также информацию образца.
После загрузки "Ну информации" файл, "Ну информация" будет выглядеть, как показано на рисунке 10
Рисунок 10. Загружено образца также информации.
- Нажмите на
Кнопка, это откроет окно Метод анализа, как показано на рисунке 2. 
Кнопка, которая принесет Window MPR установки сверху. 
кнопки. Это позволит выбрать позицию для использования в стандартах. Эти позиции будут выделены зеленым цветом. 
Кнопка, это будет выделить те позиции в желтый цвет. 
кнопки. Окна Windows Explorer откроет которые, как показано на рисунке 9, который позволит размещения "Ну information.csv" файл и загрузить его. 
2. Picogreen Пробирной пробоподготовки
- Подготовка 1X ТЕ буфера (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА), добавив 1 мл 20 X TE буферадо 19 мл ди-H 2 O.
- Подготовка реагентов PicoGreen Решение добавлением 50 мкл 200 X PicoGreen реагента до 9,95 мл 1 Буфер X TE.
- Подготовка стандартов (Lambda двухцепочечной ДНК) путем последовательных разведений фондовом двухцепочечной ДНК (100 мкг / мл). Первый приготовить раствор из 50 мкг / мл дц, добавив 25 мкл фондовом двухцепочечной ДНК (100 мкг / мл) и 25 мкл 1 х ТЕ буфера. Затем подготовить стандартные решения, добавив указанные объемы двухцепочечной ДНК и буфер, которые перечислены в таблице ниже:
Концентрация двухцепочечной ДНК Объем двухцепочечной ДНК Объем буфера 1 мкг / мл 20 мкл 50 мкг / мл двухцепочечной ДНК 980 мкл 1 X TE буфера 0,1 мкг / мл 100 мкл 1 мкг / мл двухцепочечной ДНК 900 мкл 1 X TE буфера 0,01 мкг / мл 100 мкл 0,1 мкг / мл двухцепочечной ДНК 900 мкл 1 X TE буфера 0,001 мкг / мл 100 мкл 0,01 мкг / мл двухцепочечной ДНК 900 мкл 1 X TE буфера
3. Измерение стандарты и образцы флуоресценции
- Внесите 150 мкл каждого стандарта в лунки A1-E1 в 96 ячейках, на рисунке 7, и в соответствии со следующей таблицей:
Хорошо Стандарт A1 1 мкг / мл B1 0,1 мкг / мл C1 0,01 мкг / мл D1 0,001 мкг / мл E1 1 X TE буфера - Внесите 150 мкл неизвестных образцов в лунки F1, чтобы H3, показано на рисунке 7
- Налейте PicoGreen раствор, приготовленный в шаге 1,2 в желоб предназначен для многоканальной пипетки использования. Использование многоканальной пипетки доставить 150 мкл решение PicoGreen в лунки А1-H3. Решение Mix и стандартов осторожно пипеткой.
- Место пластину в темную область и подождите 2-5 минут для реакции на развитие.
4. Представитель Результаты
Хороший калибровочной кривой оценивается с помощью различных параметров предоставляемых F-7000 программное обеспечение по измерению стандартов и расчет калибровочной кривой с использованием программного обеспечения.
Коэффициент детерминации указывает степень согласия измеренных стандартам и рассчитан калибровочной кривой. Чем ближе это значение на "1", лучше подходят от измеряемой величины и калибровочной кривой.
Если значение равно далек от "1", стандарты должны быть переоцениваются, подготовленный еще раз, или фитнес-калибровочной кривой изменился.
На рисунке 11 приведен пример калибровочной кривой с расчетной коэффициент детерминации = 0,99993, полученные для количественного определения дцДНК использованием PicoGreen красителя.
Рисунок 11. Пример калибровочной кривой двухцепочечной ДНК.
Discussion
Тщательное пипетки во время подготовки проб, а также с помощью стабильной и чувствительной флуоресценции спектрофотометр имеет важное значение для получения хороших и воспроизводимые результаты.
В случае флуоресценции использовали спектрофотометр для этого теста, он предложил использовать 300 мкл конечного объема выборки в микропланшетного. Нижний объем уменьшается чувствительность, и большего объема может привести к перекрестного загрязнения между скважинами.
Disclosures
Луис А. Морено и Кендра Л. Кокс являются сотрудниками Hitachi высоких технологий Америки, которая производит инструмент, используемый в этой статье.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled H2O | Reagent | |||
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit from Invitrogen | Reagent | P7589 | ||
| Nalge Nunc Fluorescence Microplates p/n 237108 | Supply | 237108 | ||
| 12 Channel Eppendorf Micropipette | Supply | 3516677 | ||
| 1000 μL Eppendorf Pipette | Supply | |||
| 200 μL Eppendorf Pipette | Supply | |||
| 10 mL serological pipet | Supply | |||
| Aluminum foil | Supply | |||
| Pipette tips | Supply | |||
| Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer with FL Solutions 2.1 | Equipment | 5J1-0003 | ||
| Microplate Reader Accessory for F-7000 | Equipment | 5J0-0139 |
References
- Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation. Analytical Biochemistry. 249 (2), 228-238 (1997).
