מדידות אלקטרו ממערכת עש חוש הריח

Summary

מערכות חוש הריח חרקים לספק הזדמנויות ייחודיות עבור odorant-Induced התגובות הקלטה בצורות של electroantennograms (EAG) והקלטות sensillum יחיד (SSR), אשר סיכם תגובות מכל קולטן נוירונים odorant (ORNs) הממוקם על האנטנה ועל מאלה שוכנו הפרט sensilla, בהתאמה.

Abstract

מערכות חוש הריח חרקים לספק הזדמנויות ייחודיות עבור odorant-Induced התגובות הקלטה בצורות של electroantennograms (EAG) והקלטות sensillum יחיד (SSR), אשר סיכם תגובות מכל קולטן נוירונים odorant (ORNs) הממוקם על האנטנה ועל מאלה שוכנו הפרט sensilla, בהתאמה. גישות אלה נוצלו להשגת הבנה טובה יותר של תקשורת כימית חרקים. גירויים זיהו אז יכול לשמש גם משיכה או דוחי אסטרטגיות ניהול חרקים מזיקים.

Protocol

1. חרקים

1. הטבור orangeworm, Amyelois transitella (ווקר) (הפרפרים: Pyralidae) המושבה במעבדה שלנו מקורם עש שנאספו עצי שקד ב Fresno, CA. מושבת חרקים שלנו נשמר בתאי סביבתיים (פרסיבל Inc, IA) בשעה 28 ± 2 ° C, 75 ± 10% לחות יחסית, ותחת 16:08 שעות (אור: חושך) תמונה המשטר.
2. עש מתעוררים נאספים מדי יום, מינית, והועבר קופסאות פלסטיק (669 מ"ל קופסת האוכל, 13 x 13 ס"מ, גובה, 4.5 ס"מ, Rubbermaid) מסופק עם עד 10 שכבות של מגבות נייר ספוג מים (צמאים Ultra סופגים, 27.9 x 27.9 ס"מ ; Safeway). מכסה קופסת הם מחורר, כדי לאפשר זרימת אוויר. הסדר זה מספק לחות יחסית ~ 100%.
3. עבור מדידות אלקטרו אנו משתמשים 2-4 ימים לאחר הופעת עשים הישן, אשר נשמרים תחת לחות גבוהה.

2. אלקטרו הכנה

1. עשים (זכרים או נקבות) הם דחפו בעדינות לתוך קצה פיפטה (200 μL, ארה"ב מדעי Inc), כי הוא לחתוך מלמעלה יש קוטר טיפ גדול (מ"מ בקירוב 2). עש הוא דחף בעדינות דרך הקצה השני עם בדל רקמה humidified נייר עד אנטנות חלק בראש לבלוט מהקצה.
2. ראש חשופים היא משותקת על ידי כיסוי הראש עם חימר שאינם ייבוש (Claytoon, ואן Aken הבינלאומי, CA) והותירה חלק קטן של עין אחת ושני האנטנה חשוף. הכנה זו ממוקמת על פלטפורמה של Micromanipulator EAG MP-12 (Syntech, גרמניה) בין שני מחזיקי אלקטרודה.
3. אנו משתמשים אלקטרודת הזכוכית עשויה צינורות 1.0 מ"מ נימי בורוסיליקט עם נימה (WPI Inc, פלורידה) ומשך במודל P-97 micropipette חולץ (סאטר מכשירים, CA) להשיג microelectrodes של פחות מ טיפ מיקרומטר. אלקטרודות מלאים בחזרה עם sensillum הלימפה הצלצול (Kaissling ו Thorson 1980). אלקטרודה אחת נועצת את האזור חשוף לעין תחת מיקרוסקופ (לייקה MZ75) ומשמש כנקודת התייחסות, בעוד אלקטרודה הקלטה להכיל את המחושים השניים. כדי להקל על הקשר, דיסטלי מגזרים מחושים 1-2 נחתכים בטרם מוכנס לתוך האלקטרודה ההקלטה. עבור אותות הקלטות sensilla בודדים, אנחנו קצת לשנות את ההגדרה שבה האלקטרודה ההקלטה משופדת תחת מיקרוסקופ (אולימפוס BX51WI; 800x הגדלה). פוטנציאל פעולה נרשמות על ידי החדרת אלקטרודה זכוכית בבסיס sensillum. איתותי הם מוגבר על ידי עכבה גבוהה טרום מגבר (Syntech, גרמניה) מוזן לתוך קו מעל UB-IDAC להיות מנותח עם AUTOSPIKE תוכנה (Syntech, גרמניה). אותות AC הם עוברים סינון הלהקה בין 100 הרץ -10,000 פוטנציאל פעולה מופקים על ידי המחשב באמצעות אלגוריתם AUTOSPIKE שמבדיל אל שוקת לשיאם אמפליטודות מרעש. תגובות של נוירונים בודדים מחושבים להגדיל (או להקטין) בתדירות פוטנציאל פעולה (קוצים לשנייה) על תדר ספונטנית.

3. כימית גירויים פרוטוקול גירוי

1. כימיקלים טוהר הגבוהה ביותר משמשים. המרכיב העיקרי של פרומון למזג את הנקבה מן orangeworm הטבור, (Z, Z) -11,13-hexadecadienal התקבל Bedoukian מחקר Inc, CT. כימיקלים בדילול מלא, w / v, עם הקסאן זכוכית מזוקקים כדי להפוך פתרונות מלאי של 10 דילולים מיקרוגרם / μL ו עשורי נעשים. Aliquot (10 μL) של גירוי כימי מומס הקסאן נטען על מסנן Whatman רצועת נייר (8x40 מ"מ), ממס הוא התאדה ידי רועדות בעדינות למשך 10 שניות מתחת למכסה המנוע קטר ורצועת ממוקם פוליפרופילן 5 מ"ל מזרק (מזרקים BD, NJ) שממנו כרכים שונים נפלטים. הקסאן לבד מזרק ריק לשמש מלאה.
2. ההכנה נערכת בזרם אוויר humidified מועברים על ידי בקר Stimulus Syntech (CS-55 דגם: Syntech, גרמניה) בשעה 20 mL / sec בה דופק גירוי של 4 mL / s נוסף עבור 500 ms. איתותי נרשמות במשך 10 שניות, החל 2 s לפני התחלתה של דופק את הגירוי. הכנה מחושים מגורה עם 500 ms הדופק שבמהלכו CA. 2 מ"ל של אוויר מטוהר מן מזרק פוליפרופילן 5 מ"ל המכיל את גירוי נוסף על זרימת האוויר הראשי. פער של לפחות 1 דקות או יותר, בעקבות התגובות גבוה, מותר בין גירויים.

4. נציג תוצאות

האנטנה של עש מאופק (איור 1) מגורה עם רכיב פרומון הנקבה, (Z, Z) -11,13-hexadecadienal ליצור תגובות חזקים תלוי במינון (איור 2). זה מרכיב מרכזי פרומון גם מעורר תלוי במינון התגובות מעוררים ממערכות ארוך trichodea sensilla (איור 3A) מוצג כמו עקבות של הקלטות יחידה אחת (איור 3B).

באיור 1. חיה הטבור orangeworm עש מאופקת אנטנה נחשפים

load/2489/2489fig2.jpg "alt =" איור 2 "/>
איור 2. תלויה במינון התגובות EAG שהושרו בתגובה (Z, Z) -11,13-hexadecadienal, מרכיב עיקרי פרומון נקבי.

איור 3. Trichoid Sensilla אצל הזכר הטבור orangeworm עש להגיב (Z, Z) -11,13-hexadecadienal באופן תלוי מינון. (א) אנטנה של הזכר הטבור orangeworm עש הוא רב מפולח וכל קטע מעוטר במספר רב של מבנים דמויי שיער, sensilla. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, מראה פרטים על הבלעה (מוטות סולם הם 200 ו - 50 מיקרומטר, בהתאמה). (ב) תאי יחיד יחידת הקלטות sensillum trichoid.

Discussion

זו שיטה חדשה שפותחה עבור הרחקה עש הטבור לחיות orangeworm למדוד אותות הריח הוכיחה להיות חזקה ואמינה מאוד. אנו להעסיק בשיטה זו באופן שגרתי עבור בידוד וזיהוי משיכה רומן מן מצעים לארח טבעי כמו שקדים ופיסטוקים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope	Olympus Corporation	BX51WI model
Stereo microscope	Leica Microsystems	MZ75
1.0 mm borosilicate capillary tubing with filament	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-3
Micropipette puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Stimulus controller	Syntech	CS-55 model
High Impedance pre-amplifiers (Universal Single ended probe)	Syntech
Amplifier / data-acquisition system (USB-IDAC)	Syntech
EAG Micromanipulator MP-12	Syntech
(Z,Z)-11,13-hexadecadienal	Bedoukian Research Inc, CT.
Whatman filter paper	Whatman, GE Healthcare	1001070
5 mL polypropylene syringe	BD Biosciences	309633
pipette tip (200 μL)	USA Scientific, Inc.	1111-0806
669 mL lunchbox,13 x 13 cm; height, 4.5 cm,	Rubbermaid
Thirsty Ultra Absorbent, 27.9 x 27.9 cm	Safeway
Non-drying clay	Claytoon , Van Aken International, CA	18150
Environmental chamber		I-30BLL model