Summary
Insect lukt system ger unika möjligheter för inspelning luktämnen-inducerade reaktioner i form av electroantennograms (EAG) och enstaka inspelningar sensillum (SSR), som sammanfattas svar från alla nervceller luktreceptor (Örns) på antennen och från dem som förvaras i enskilda sensilla, respektive.
Abstract
Insect lukt system ger unika möjligheter för inspelning luktämnen-inducerade reaktioner i form av electroantennograms (EAG) och enstaka inspelningar sensillum (SSR), som sammanfattas svar från alla nervceller luktreceptor (Örns) på antennen och från dem som förvaras i enskilda sensilla, respektive. Dessa metoder har utnyttjats för att få en bättre förståelse av insekter kemisk kommunikation. De identifierade stimuli kan sedan användas antingen som tilldragande eller repellenter i förvaltningsstrategier för skadeinsekter.
Protocol
1. Insekter
- Navel orangeworm, Amyelois transitella (Walker) (Lepidoptera: Pyralidae) koloni i vårt laboratorium kom från malar som samlats in från mandelträd i Fresno, Kalifornien. Vår insekter koloni behålls i miljö-kammare (Percival Inc, IA) vid 28 ± 2 ° C, 75 ± 10% relativ luftfuktighet, och under 16:08 h (ljus: mörk) foto regim.
- Nya fjärilar samlas upp dagligen, könsbestämmas och överföras till plastlådor (669 ml Lunchbox, 13 x 13 cm, höjd 4,5 cm, Rubbermaid) förses med upp till 10 lager av vatten indränkt pappershanddukar (Törstig Ultra absorberande, 27,9 x 27,9 cm , Safeway). Box täcker är perforerade för att möjliggöra luftcirkulation. Detta arrangemang ger ~ 100% RH.
- För elektrofysiologiska mätningar använder vi 2-4 dagar gamla malar efter uppkomst, som hålls under hög luftfuktighet.
2. Elektrofysiologiska Förberedelser
- Nattfjärilar (män eller kvinnor) är försiktigt skjuts in i en pipettspets (200 mikroliter, USA vetenskapliga Inc) som skärs från toppen att ha en stor (ca. 2 mm) spets diameter. En mal är försiktigt drivit igenom den andra änden med en fuktad silkespapper stöta tills antenner och en del av huvudet sticker ut från spetsen.
- Utsatt huvudet fixeras genom att täcka huvudet med en icke-torkning lera (Claytoon, Van Aken International, Kalifornien) lämnar en liten del av ett öga och två antenn utsatt. Detta preparat är placerad på en plattform av EAG mikromanipulator MP-12 (Syntech, Tyskland) mellan de två elektrodhållare.
- Vi använder glaselektrod tillverkade av 1,0 mm borosilikat kapillärrör med glödlampa (WPI Inc, FL) och drog i en modell P-97 mikropipett avdragare (Sutter Instrument, CA) för att erhålla microelectrodes på mindre än en mikrometer spets. Elektroder är tillbaka fyllda med sensillum lymfan ringsignal (Kaissling och Thorson 1980). En elektrod spetsar den exponerade delen av ögat i mikroskop (Leica MZ75) och tjänar som referens, medan inspelningen elektroden rymmer två antenner. För att underlätta kontakten är distala 1-2 antennal segment skära innan de sätts in i inspelningen elektroden. För inspelningar signaler från enskilda sensilla, ändra vi lite den här inställningen där inspelningen elektroden är spetsad i mikroskop (Olympus BX51WI, 800x förstoring). Aktionspotentialer registreras genom att sätta in glaselektrod vid foten av ett sensillum. Signaler förstärks av en hög impedans förförstärkare (Syntech, Tyskland) och matas in i en UB-IDAC att analysera off-line med AUTOSPIKE programvara (Syntech, Tyskland). AC-signaler är bandpass filtrerade mellan 100 -10.000 Hz och potentialer åtgärder utvinns genom datorn med ett AUTOSPIKE algoritm som skiljer deras topp-till-botten amplituder från buller. Svaren från enskilda nervceller beräknas som ökning (eller minskning) av aktionspotential frekvens (spikar per sekund) över den spontana frekvensen.
3. Kemiska stimuli och stimulans protokoll
- Kemikalier av högsta renhet används. En viktig beståndsdel i den kvinnliga feromoner blandning från naveln orangeworm, (Z, Z) -11,13-hexadecadienal har erhållits från Bedoukian Research Inc, CT. Kemikalier späds, är w / v, med glas-destillerat hexan för att göra stamlösningar av 10 mikrogram / mikroliter och decadic spädningar görs. En alikvot (10 mikroliter) med en stimulans kemiska löst i hexan lastas en Whatman filterpapper remsor (8x40 mm), är lösningsmedlet avdunstat genom att försiktigt skaka i 10 s vid ett dragskåp och remsan placeras i en 5 ml polypropylen spruta (BD Sprutor, NJ) från vilket olika volymer har matats ut. Hexan ensam och en tom spruta tjäna som kontroll.
- Beredningen hålls i en fuktig luftström levereras av Syntech Stimulus controller (CS-55 modellen, Syntech, Tyskland) på 20 ml / sek som en stimulans puls av 4 mL / s är till för 500 ms. Signaler registreras under 10 s, med start 2 s före inträdet av den stimulans puls. Antennal förberedelser stimuleras med 500 ms puls då ca. 2 mL den renade luften från en 5 ml polypropen spruta med stimulans läggs på den största luftflödet. Ett avstånd på minst 1 min eller mer, efter höga svar, är tillåtet mellan stimuli.
4. Representativa resultat
Antenner på återhållen nattfjärilar (Figur 1) stimuleras med kvinnliga feromon komponent, (Z, Z) -11,13-hexadecadienal skapa robusta dosberoende svar (figur 2). Denna stora feromon del framkallar också dosberoende excitatoriska svar från långa trichodea sensilla (Figur 3A) som visas i spåren av enhet inspelningar (Figur 3B).
Figur 1. Live naveln orangeworm mal återhållsamma och antenn utsatta
load/2489/2489fig2.jpg "alt =" Figur 2 "/>
Figur 2. Dosberoende EAG svar framkallade ett svar på (Z, Z) -11,13-hexadecadienal, en stor hona feromon beståndsdel.
Figur 3. Sensilla trichoid hos manliga naveln orangeworm nattfjäril svara (Z, Z) -11,13-hexadecadienal på ett dosberoende sätt. (A) Antenn manliga naveln orangeworm mal är multi-segment och varje segment är prydd med ett stort antal hår som strukturer, sensilla. En skanning elektron mikroskop, som visar detaljer i infällda (Skala barer är 200 och 50 mikroM respektive). (B) Extracellulär enda enhet inspelningar från en trichoid sensillum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna nya metod som utvecklats för att hålla fast ett levande navel orangeworm mal att mäta lukt signaler har visat sig vara robust och mycket tillförlitlig. Vi använder rutinmässigt den här metoden för att isolera och identifiera nya tilldragande från naturliga värd substrat som mandlar och pistaschmandlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Med stöd av USDA-NIFA/AFRI 2010-65105-20582, NSF 0.918.177 och Bedoukian forskning bolagsordningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus Corporation | BX51WI model | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ75 | |
| 1.0 mm borosilicate capillary tubing with filament | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-3 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Stimulus controller | Syntech | CS-55 model | |
| High Impedance pre-amplifiers (Universal Single ended probe) | Syntech | ||
| Amplifier / data-acquisition system (USB-IDAC) | Syntech | ||
| EAG Micromanipulator MP-12 | Syntech | ||
| (Z,Z)-11,13-hexadecadienal | Bedoukian Research Inc, CT. | ||
| Whatman filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1001070 | |
| 5 mL polypropylene syringe | BD Biosciences | 309633 | |
| pipette tip (200 μL) | USA Scientific, Inc. | 1111-0806 | |
| 669 mL lunchbox,13 x 13 cm; height, 4.5 cm, | Rubbermaid | ||
| Thirsty Ultra Absorbent, 27.9 x 27.9 cm | Safeway | ||
| Non-drying clay | Claytoon , Van Aken International, CA | 18150 | |
| Environmental chamber | I-30BLL model |
References
- Sattelle, D. B., Hall, L. M., Hildebrand, J. G. Insect olfactory sensilla: structural, chemical and electrical aspects of the functional organization. Receptors for Neurotransmitters. Hormones and Pheromones in Insects. , Elsevier North-Holland. Amsterdam. 261-282 (1980).
